脊髓脑源性神经营养因子表达水平评估大鼠坐骨神经缺损修复程度

许松云，逄 鑫，王宝华

随着神经科学领域取得的重大进展，对于周围神经缺损的修复，出现了许多人工神经移植物，但离理想的修复效果尚有差距，自体神经移植仍然是周围神经缺损修复的“金标准”［1］。随着各种新的神经替代物大量的出现，对其修复神经的效果需要有一个客观评价。本文通过免疫荧光的方法，应用脊髓脑源性神经营养因子（BDNF）的表达水平来评价周围神经损伤修复的效果。

1 材料和方法

1．1 实验动物及分组 取健康成年SD大鼠30只，体重200～250 g。随机分成正常组、自体神经组和硅胶管组，每组10只。

1．2 手术方法 用 0．25%硫喷妥钠（1 ml／100 g）腹腔注射麻醉大鼠，右股部显露坐骨神经，距梨状肌下孔1 cm处切除10 mm神经，造成神经缺损。自体神经组将剪断的神经原位缝合于神经两断端间的缺损处，并注入5 mg神经营养因子。硅胶管组在造成坐骨神经缺损10 mm后，用等长的医用硅胶管，桥接于神经两断端，并注入5 mg神经营养因子。正常组不实施手术，和其他组一起饲养。术后各组大鼠均常规饲养4个月。

1．3 标本的取材 术后4个月，给予大鼠腹腔注射0．25%硫喷妥钠麻醉后，依次剪开胸腔、右心房，心室，再剪开左心室，将输液管通过左心室插入主动脉内，快速灌注生理盐水150 ml，快速灌注4%多聚甲醛 200 ml，缓慢滴注 300 ml，持续 1．5～2．0 h，进行固定。仔细沿横棘突打开椎板，注意不损伤脊髓，取脊髓腰膨大段（L3～L6），浸入 20%蔗糖液，冰箱 4 ℃过夜，恒冷箱横断面切片。

1．4 BDNF免疫荧光染色 所有组织均置于冷冻胶中包埋，做冷冻切片厚为7 μm，染色方法如下：组织切片晾干后，放入4%多聚甲醛内固定10 min；0．02MPBS冲洗3 min×3次；滴加山羊血清液封闭抗原20 min，甩去封闭液；分别滴加1∶150稀释的兔抗大鼠BNDF抗体，在37℃湿盒孵育40 min；0．02MPBS 冲洗，3 min×3 次； 滴加 1∶200 红色荧光标记山羊抗兔单克隆抗体（IgG），37℃湿盒孵育30 min； 0．02M PBS 冲洗，3 min×3 次，封片，在荧光显微镜下观察脊髓前角。

2 结 果

通过免疫荧光染色，可见各组脊髓前角内均有BDNF表达，表现为点状红色荧光，均匀弥漫分布，胶质细胞内及周围均有分布，未染出神经元。光密度正常组＞自体神经组＞硅胶管组。硅胶管组红色荧光密度最低，可见较多黑色背景区域（图1～3）。

图1 正常组脊髓前角脑源性神经营养因子的表达（×400）

图2 自体神经组脊髓前角脑源性神经营养因子的表达（×400）

图3 硅胶管组脊髓前角脑源性神经营养因子的表达（×400）

3 讨 论

脑源性神经营养因子（BDNF）是神经营养因子中的重要一员［2］，在中枢神经系统中，对神经元的生存、分化、生长及执行功能起重要作用，已引起人们的重视。BDNF对正常哺乳动物运动神经元具有广泛的作用，其高亲和性受体trkB在脊髓前角运动神经元内有一定的表达。周围神经损伤后其表达明显上调，这种上调与神经损伤后轴突摄取与逆行转运BDNF明显增加是一致的。BDNF具有引导轴突延伸塑形，促进周围神经损伤后再生和髓鞘形成，还对神经元的保护起重要作用［3］。脊髓前角内BDNF的表达水平可以反映坐骨神经再生的质量［4］。本研究采用免疫荧光的方法检测脊髓前角内BDNF水平，结果显示脊髓内可见点状红色荧光，均匀弥漫分布，胶质细胞内及周围均有分布，未染出神经元细胞，荧光密度的多少反映BDNF水平的多少。本研究正常组BDNF水平多于自体神经组，自体神经组多于硅胶管组，BDNF水平与坐骨神经恢复水平呈正相关，因此可以应用脊髓脑源性神经营养因子表达水平来评价周围神经损伤恢复的情况。

［1］ Deumens R，Bozkurt A，Meek MF，et al．Repairing injuried peripheral nerves： Bridging the gap［J］．Prog Neurobiol，2010，92（3）：245－276．

［2］ Autry AE，Monteggia LM．Brain－derived neurotrophic factor and neuropsychiatric disorders ［J］．Pharmacol Rev，2012，64（3）：238－258．

［3］ Zhang HY，Jin XB，Lue TF．Three important components in the regeneration of the cavernous nerve：brain－derived neurotrophic factor，vascular endothelial growth factor and the JAK／STAT signaling pathway［J］．Asian J Androl，2011，13（2）：231－235．

［4］李昌琪，刘 丹，卢大华，等．小鼠坐骨神经损伤后内源性BDNF对脊髓前角运动神经元内突触素I mRNA表达的调节［J］．神经解剖学杂志，2005，21（4）：345－349．