注射用七叶皂苷钠无菌检查方法学验证

杭州澳亚生物技术有限公司（310018）徐全华 陈青连 李红菊

七叶皂苷钠是从七叶树科植物天师栗的干燥成熟种子中提取得到的皂苷钠盐，具有消肿、抗炎和改善血液循环的作用。用于脑水肿、创伤或手术后引起的肿胀，也用于静脉回流障碍性疾病。

根据中国药典2010年版二部无菌检查法的规定[1]，建立药品无菌检查方法时，应该进行方法学验证，以证明方法的适用性。为确保该产品检查方法科学、结果准确，本文建立了注射用七叶皂苷钠无菌检查方法，并对检查方法进行了验证。

1 仪器与材料

XG1.DWXD-0.36型脉动真空灭菌器（山东新华医疗器械厂）；HTY-Ⅲ型智能集菌仪（杭州泰林生物技术设备有限公司）；KDGB220、KDGB330型一次性全封闭集菌培养器（杭州泰林生物技术设备有限公司）；LRH-250-Ⅱ型、LRH-250型生化培养箱（广东省医疗器械厂）。

注射用七叶皂苷钠（规格：5mg，杭州澳亚生物技术有限公司生产，批号：1106145、1106184、1106185）。

试验用菌株：金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）［CMCC(B)26003]；铜绿假单孢菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC(B)10104]；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）[CMCC(B)63501]；生孢梭菌（Clostridium sporogenes）[CMCC(B)64 941]；大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC(B)44 102]；白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC(F)980 01]；黑曲霉（Aspergillus niger）[CMCC(F)98003]。上述菌种由中国药品生物制品检定所提供。

验证用培养基：硫乙醇酸盐流体培养基；改良马丁培养基；营养肉汤培养基；营养琼脂培养基；玫瑰红钠琼脂培养基；改良马丁琼脂培养基。上述培养基由杭州微生物试剂有限公司提供。

稀释液和冲洗液：0.1%蛋白胨水溶液（杭州澳亚生物技术有限公司质检部配制）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜培养物，用白金耳接种至营养肉汤培养基中，取生孢梭菌的新鲜培养物，用白金耳接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，32.5℃培养24h。取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，25.5℃培养24h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。

取黑曲霉斜面的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基上，25.5℃培养5d使大量孢子成熟，加5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，用白金耳轻轻将孢子洗脱，用管口带纱布的无菌毛细吸管吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠注射液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。

2.2 菌液计数 分别取金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、生孢梭菌各1ml于培养皿中，每种菌做两个平皿，加营养琼脂培养基；取白色念珠菌、黑曲霉菌各1ml于培养皿中，每种菌做两个平皿，加玫瑰红钠琼脂培养基，按规定条件培养，结果见附表1。由附表1可知，各菌种在相应的稀释度下，每毫升菌落计数结果符合规定。

附表1 微生物计数结果

2.3 培养基的无菌性试验 取硫乙醇酸盐流体培养基和改良马丁培养基各8支，在相应培养条件下培养14d，结果显示两种培养基的无菌性符合规定，见附表2。（注：“+”代表有菌生长，“-”代表无菌生长，以下表格符号意义相同）

附表2 培养基的无菌性检查结果

2.4 培养基的灵敏度试验 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，按相应条件培养3d。取每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，按相应的条件培养5d。每天观察记录，结果见附表3。由附表3可知，培养基的灵敏度试验结果符合规定。

附表3 培养基的灵敏度试验结果

2.5 薄膜过滤法方法学验证 每批取供试品180支，用0.1%蛋白胨缓冲液溶解供试品，每10支为一组，分成18组，每组使用一个过滤器，其中6组未用冲洗液冲洗，另6组冲洗量为100ml，再6组冲洗量为200ml，在最后一次冲洗液中加入每1ml小于100cfu的试验菌1ml，过滤后，将相应的培养基100ml加至各滤筒内作为供试品阳性对照（PPC）。另取集菌培养器，不过滤供试品，其他操作同上，作为阳性对照（PC）。按规定温度培养3～5d，各试验菌同法操作，结果见附表4、附表5、附表6。由附表4～6可知，三批产品在设定冲洗量为未冲洗、100ml和200ml条件下，对6种菌株而言供试品阳性对照和阳性对照均生长良好，且无明显差异，均无抑菌作用，因此确定该产品无菌检查方法为：取本品，用0.1%蛋白胨水溶液溶解，采用薄膜过滤法过滤，无需经冲洗液冲洗，直接加相应的培养基培养。

附表4 注射用七叶皂苷钠方法学验证结果（批号：1106145）

2.6 样品的无菌检查 每批取供试品30支，用0.1%蛋白胨水溶液溶解供试品，取三联管全封闭集菌培养器直接过滤，其中一管加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基，另一管加入100ml改良马丁培养基，第三管加入100ml硫乙醇酸盐流体培养基并接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌菌液作供试品阳性对照，另取稀释液，同法操作，作为阴性对照，按规定温度培养14d，结果见附表7。由附表7可知，三批产品按验证确定的方法进行检查，供试品阳性对照和阴性对照均成立，产品符合无菌要求。

附表5 注射用七叶皂苷钠方法学验证结果（批号：1106184）

附表6 注射用七叶皂苷钠方法学验证结果（批号：1106185）

附表7 样品无菌检查试验结果

3 讨论

根据《中国药典》二部附录Ⅺ无菌检查法的要求，无菌检查法包括薄膜过滤法和直接接种法，只要供试品性状允许，应采用薄膜过滤法，因此本品采用薄膜过滤法进行了相应的研究。此外，由于注射用七叶皂苷钠为非抗菌药物，因此，选择金黄色葡萄球菌作阳性对照菌。研究结果表明：注射用七叶皂苷钠在试验菌液计数及所用培养基无菌性、灵敏度符合规定条件下，三批产品经验证各阳性对照组生长情况均成立，未经冲洗和冲洗量为100ml和200ml的供试品阳性对照组生长情况与阳性对照组均生长良好，并且无明显差异，无抑菌作用。三批样品经检查，符合无菌要求。因此，确定该产品无菌检查方法为：取本品，用0.1%蛋白胨水溶液适量使溶解，用薄膜过滤法处理后，无需冲洗液进行冲洗，依法检查，应符合规定。通过上述验证所建立的方法可用于注射用七叶皂苷钠的无菌检查，结果准确、可靠。