氯霉素水杨酸搽剂微生物限度检查方法的验证

天津市水阁医院（300100）邓菲 宋莹

氯霉素水杨酸搽剂是氯霉素、水杨酸等组成的外用化药制剂，有止痒、杀菌、溶解脂肪酸的作用，用于治疗痤疮、酒糟鼻、脂溢性伴毛囊炎型皮炎。根据《中国药典》2010年版的规定，药品在进行微生物限度检查前必须对其检查方法进行验证，以确认该供试品所采用的检查方法无抑菌作用后在进行检查，才能真实反映该药品受污染的程度[1]。结果证实氯霉素水杨酸搽剂的细菌、霉菌、酵母菌和控制菌检查均采用常规法。

1 仪器与试药

1.1 仪器 LIBRORAEG120电子天平（川本岛津）；YJA电动匀浆仪（台州市椒江五星机械仪器有限公司）；MJX-1501培养箱（广东省医疗器械厂）。

1.2 试药与培养基 营养琼脂培养基（批号080919），玫瑰红钠琼脂培养基（批号080606），胆盐乳糖培养基（批号080528），营养肉汤培养基（批号070111），pH7.0的无菌氢氧化钠-蛋白胨缓冲液（批号070413），改良马丁培养基（批号080408）均为中国药品生物制品检定所提供；氯霉素水杨酸搽剂（批号20120815，20120816，20120817）。

1.3 菌种 大肠埃希菌[CMCC(B)44102]；金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]；枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]；白色念珠菌[CMCC(F)98001]；黑曲霉[CMCC(F)98003]；铜绿假单孢菌[CMCC(B)10104]，均由中国药品生物制品检定所提供。

2 方法与结果

2.1 菌液制备 取大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物接种至营养肉汤培养基中，34℃培养18～24h；取白色念珠菌的新鲜培养物接种至改良马丁培养基中，26℃培养24～48h。上述培养物用0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数约为50～100cfu的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至改良马丁琼脂斜面培养基中，经26℃培养5～7d后，加入3～5ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，将霉菌孢子洗脱。然后吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数为50～100cfu的菌悬液。

2.2 供试液的制备 取本品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇均匀，制成1∶10的供试液。

2.3 方法验证

2.3.1 细菌、霉菌和酵母菌计数的验证

2.3.1.1 细菌计数的验证

2.3.1.1.1 试验组 取本品1ml过膜，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml分次冲洗，并在最后一次的冲洗液中加入规定量试验菌（50～100cfu），取滤膜贴于相应的培养基上。

2.3.1.1.2 菌液组 取1ml试验菌（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注营养琼脂培养基，测定所加菌数。

2.3.1.1.3 供试品对照组 取供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底细菌数。

2.3.1.1.4 稀释剂对照组 取规定量试验菌，同供试品处理后，取1ml（含试验菌约50～100cfu）薄膜过滤，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml分数次冲洗后，取滤膜贴于相应的培养基上。

2.3.1.2 霉菌和酵母菌计数的验证

2.3.1.2.1 试验组 取本品10ml，加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液至100ml，振摇均匀，制成1∶10的供试液。取1∶10供试液1ml和规定量试验菌（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，每株试验菌平行制备两个平皿。

2.3.1.2.2 菌液组 取1ml试验菌（约50～100cfu），分别注入平皿中，立即倾注玫瑰红钠琼脂培养基，测定所加菌数。

2.3.1.2.3 供试品对照组 取供试液1ml，按菌落计数方法测定供试品本底菌数。

试验组菌回收率＝（试验组菌落数-供试品对照组菌落数）/试验组菌落数×100%。

稀释剂对照组回收率＝稀释剂对照组菌落数/试验组菌落数×100%。

《中国药典》规定对各试验菌株的回收率均不得低于70%。测定该品种对5个试验菌株的回收率，以确定其抑菌程度。由附表1可知本品对大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌和黑曲霉有抑菌作用。结果见附表1。

附表1 各试验菌株的回收率（%）

2.3.2 控制菌检查法的验证

2.3.2.1 金黄色葡萄球菌检查法的验证

2.3.2.1.1 试验组 取本品1ml过膜，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml分次冲洗，并在最后一次冲洗液中加入规定量的金黄色葡萄球菌（约10～100cfu），取滤膜加入到100ml营养肉汤培养基中，培养24～48h。

2.3.2.1.2 阳性对照组 取规定量金黄色葡萄球菌（约10～100cfu），加入到100ml营养肉汤培养基中，培养24～48h。取试验组、阳性对照组上述培养物，划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，培养24～72h，平板上均呈现典型菌落。

2.3.2.1.3 实验结果 阳性对照组检出金黄色葡萄球菌，试验组检出金黄色葡萄球菌；验证结果符合要求。

2.3.2.2 铜绿假单孢菌检查法的验证

2.3.2.2.1 试验组 取本品1ml过膜，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml分次冲洗，并在最后一次冲洗液中加入规定量的铜绿假单孢菌（约10～100cfu），取滤膜加入到100ml胆盐乳糖培养基中，依法检查。

2.3.2.2.2 阳性对照菌 取规定量铜绿假单孢菌（约10～100cfu），加入到100ml胆盐乳糖培养基中，培养18～24h。取试验组、阳性对照组上述培养物，划线接种于溴化十六烷三甲胺琼脂培养基平板上，培养18～24h，平板上均呈现典型菌落。

2.3.2.2.3 实验结果 阳性对照组检出铜绿假单孢菌，试验组检出铜绿假单孢菌；验证结果符合要求。

2.3.2.3 供试品控制菌检查

2.3.2.3.1 金黄色葡萄球菌 取本品1ml过膜，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml分次冲洗，取滤膜加入到100ml营养肉汤培养基中，依法检查，结果每1ml样品中未检出金黄色葡萄球菌。

2.3.2.3.2 铜绿假单孢菌 取本品1ml过膜，用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300ml分次冲洗，取滤膜加入到100ml胆盐乳糖培养基中，依法检查，结果每1ml样品中未检出铜绿假单孢菌。

2.4 按验证合格的方法进行本品微生物限度检查，结果见附表2。

附表2 氯霉素水杨酸搽剂微生物限度检查结果

3 讨论

制剂的微生物限度检查通常是按常规的药品卫生学检验方法进行细菌、霉菌和酵母菌计数的。由于本品是含有多种成分的化学药制剂，其中任何具有抑菌作用的成分均可影响微生物限度检查的准确性。为此，本实验以5种阳性对照菌的回收率作为评价指标，确定了氯霉素水杨酸搽剂的微生物限度检查方法。该方法可用于氯霉素水杨酸搽剂微生物的质量控制。