转化生长因子TGF－β1+869T/C基因多态性与子痫前期的相关性研究

廖志琼 甘 婷 陈晞明 吴爱华 廖德贵 陈盛强 肖国宏 方朝辉

迄今为止，子痫前期(Pre－Eclampsia)仍是孕产妇及围产儿死亡的重要原因之一。子痫前期的发病原因尚不十分清楚，可能发病机制主要包括遗传缺陷、胎盘微环境的损伤和免疫异常等［1－4］。三种机制在不同患者中单独或联合作用，导致胎盘功能异常，其中免疫和遗传学病因越来越引起人们的重视。TGF－β1广泛参与哺乳类动物的各种生理过程。在机体免疫系统中TGF－β1又是一个重要的免疫调节因子，参与维持自身免疫耐受和T细胞稳态。近年来研究发现TGF－β1是一种多功能的细胞因子，TGF－β1表达水平异常与某些疾病的发生发展密切相关。有研究表明，适量的TGF－β1对胎儿生长发育是必需的。蜕膜和滋养细胞中TGF－β1的合成与分泌在胎盘发育和胚胎生长中起着重要作用［5－7］。而 TGF－β1表达异常可以使滋养细胞向子宫内层浸润受限，子宫胎盘血流减少，致使滋养细胞浅植入和子宫胎盘血管的异常高阻抗，形成子痫前期的病理生理改变，导致子痫前期的发生［8］。TGF－β1表达异常与子痫前期发生可能涉及了十分复杂的分子调控机制［9］。TGF－β1存在基因多态性，国内外的研究显示TGF－β1基因多态性和特定基因型是疾病的危险因素［10－12］，TGF－β1基因多态性是通过何种机制导致子痫前期的发生，目前仍不清楚。由于该基因在不同地域和种族之间存在较大基因多态及基因型差异。我们对转化生长因子TGF－β1+869T/C基因多态性与子痫前期的相关性进行了探讨，为子痫前期的预测和预防提供理论依据和实验基础。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2010年10月～2011年12月期间在广州医科大学第二、第三附属医院产科住院的156例子痫前期患者作为研究对象，临床诊断均符合乐杰主编《妇产科学》(第7版)中的标准［13］;另选择同期在上述两院产科正常分娩的足月妊娠孕妇252例作为对照组。剔除妊娠期间发生内科合并症和产科并发症的病例，两组研究对象孕前均无高血压、心脏病、肾病、糖尿病、血小板减少等病史。两组孕妇的一般临床资料如表1所示，两组孕妇的年龄、孕周比较没有统计学差异(p＞0.05);子痫前期组孕妇早产和剖宫产的发生率均明显高于对照组(p＜0.05)，而胎盘重量和新生儿体重则明显低于对照组(p＜0.01)。

表1 子痫前期组和对照组孕妇的一般临床资料比较 (%)

1.2 样本采集

所有研究对象均于清晨空腹采集静脉血3.0 ml，置EDTA－K2抗凝无菌真空管中混匀，离心分离血浆，4℃保存备用。

1.3 主要试剂

TaqDNA聚合酶和dNTP由鼎国生物技术公司提供，Pst Ι内切酶由宝生生物工程(大连)有限公司提供。引物由赛百盛有限公司合成，根据参考文献［14］提供的引物序列:

上游引物5'－CAGACTCTAGAGACTGTCAG－3'，

下游引物5'－GTCACCAGAGAAAGAGGAC－3'。

1.4 DNA 模板制备

采用Gentra公司的试剂盒，抽提标本基因组DNA模板。

1.5 扩增 TGF－β1+869T/C

PCR 反应体系总体积为 30 μl，模板 DNA 1 μl(约1 μg)，10 × 缓冲液 3 μl，Taq 酶 1 μl(约 1 U)，25 mm ×MgCl21 μl，引物分别 为 1 μl(20 pmol)，dNTP 1 μl(100 μmol/L)，用双蒸水补足至 30 μl。PCR 扩增条件:94℃预变性5 min，然后以下列温度和时间循环30次:94℃ 45 s、58℃ 45 s、72℃ 45 s。末次循环后继续于72℃延伸7 min，PCR扩增反应完毕。取PCR扩增产物15 μl用 Pst Ι内切酶 0.5 μl(10 U/μl)，10 × 缓冲液 2 μl，用双蒸水补足至20 μl。混匀，5 000 r/min离心2 min后，37℃水浴过夜。取酶切产物在3%琼脂糖凝胶板于0.5×TBE电泳缓冲液电泳检测酶切结果(106 V，35 min)，紫外反射投射仪观察结果并拍照。

1.6 DNA序列测定法验证酶切法检出的 TGF－β1+869T/C基因型

从用酶切法已鉴定出基因型的标本中随机抽取10例，PCR扩增产物纯化后，按标准程序在ABI 3100全自动序列分析仪上进行双向测序并分析。

1.7 统计学处理

采用SPSS 11.5统计学软件包进行统计学分析，一般临床资料的组间比较采用t检验;计算基因的等位基因频率、基因型频率、基因多态性与疾病的相关性及相对危险度，组间比较用χ2检验，表达强度用等级资料秩和检验。

2 结果

2.1 目的基因片段扩增

采用TGF－β1+869T/C位点特异性引物经PCR扩增后，得到大小约110 bp的基因片段，与目的基因片段大小相符。

2.2 TGF－β1+869T/C等位基因的指定

将扩增片段做RFLP分析，经PstⅠ酶切后可产生3种酶切类型:①TGFβ1+869 CC纯合子基因型，可被酶切为86 bp和24 bp两个片段;② TGFβ1+869 TT突变纯合子基因型，因发生了PstⅠ酶切位点的突变而不被酶切，电泳后只出现110 bp条带;③ TGFβ1+869 TC杂合子基因型，经PstⅠ内切酶消化后产生部分酶切，可出现86 bp、24 bp和110 bp三个条带。TGFβ1+869T/C基因位点多态性分析结果见图1。

将上述三种基因型的PCR扩增产物进行DNA序列测定，结果见图2:①TGFβ1+869 CC纯合子基因型的序列为:GCTGCCGCA;② TGFβ1+869 TT突变纯合子基因型的序列为:GCTGCTGCA;③ TGF－β1+869 CT杂合子基因型的序列为:GCTGCC/TGCA。限制性内切酶片段长度多态性分析与DNA测序的结果是一致的。

图1 TGF－β1+869T/C位点基因型PCR－RFLP分析电泳图

图2 TGF－β1+869T/C位点各基因型测序图

2.3 子痫前期组与对照组孕妇TGF－β1+869T/C基因型与等位基因频率的分布

TGF－β1基因+869T/C位点存在CC、CT、TT三种基因型，子痫前期组CC基因型占33.33%(52/156)，CT基因型占62.18%(97/156)，TT基因型占4.49%(7/156);对照组 CC基因型占 13.10%(33/252)，CT基因型占48.41%(122/252)，TT基因型占38.49%(97/252)。子痫前期组孕妇CC基因型频率明显高于对照组，RR=1.803，95%CI为1.214 ～2.713，χ2=23.93，p＜0.01;CT基因型频率也明显高于对照组，相对危险系数RR=1.852，95% 可信区间(95%CI)为 1.251 ～2.821，χ2=7.34，p＜0.01;而TT基因型频率则明显低于对照组，RR=0.119，95%CI为0.0814 ～0.286，χ2=58.66，p＜0.01。子痫前期组孕妇外周血TGF－β1+869T/C位点C等位基因频率(64.42%)明显高于对照组(37.30%)，T等位基因频率(35.58%)明显低于对照组(62.70%)，χ2=56.82，p＜0.01，相对危险系数RR=3.044，95%可信区间(95%CI)为1.563 ～4.821，结果见表2。

表2 子痫前期组与对照组TGF－β1+869T/C位点基因型和等位基因频率的分布

2.4 群体代表性检验

子痫前期组和对照组TGF－β1+869T/C基因型分布经χ2检验p＞0.05，符合Hardy－Weinbern平衡定律，这表明两组研究对象来自同一群体。

3 讨论

TGF－β1是一种多功能的生物活性生长因子，其在细胞分化活跃的组织中含量较高，可对众多的组织器官产生生物学效应。具有调节细胞生长、分化、抑制炎症、促进组织修复和胚胎发育等功能。TGF－β1可能还参与了机体血压的调节，有研究发现高血压患者外周血中TGF－β1浓度与血压水平呈正相关［14］，认为TGF－β1的升高可能与其对血管内皮细胞的作用相关，内皮素(Endothelin，ET)被认为是迄今最有效的缩血管多肽，TGF－β1高表达后可能刺激血管内皮细胞的内皮素mRNA表达，使内皮素增多，血管平滑肌收缩，血压升高［15－16］，TGF － β1 也可能促进肾脏释放肾素，使血管紧张素II升高，导致肾素－血管紧张素－醛固酮系统失衡，使血压升高，产生高血压的一系列临床症状。

2000年后，随着人类基因组计划的完成，有关基因结构和功能的研究进展迅速，基因多态性与疾病易感性的研究越来越引人关注，成为研究的热点。其中TGF－β1基因多态性与疾病相关性的研究也取得了令人鼓舞的成果。有研究报道 TGF－β1－509C/T、+869T/C及 +915G/C基因位点多态性可能与原发性高血压发病相关［14］。

目前认为，子痫前期的遗传因素是由若干作用微小但有累积效应的致病基因构成。个体携带的基因型可能影响疾病的易患性和疾病的程度。迄今为止，子痫前期易感基因尚不清楚。研究子痫前期易感基因对子痫前期的预测与预防具有重要意义与价值［17］。人的TGF－β1基因定位于19q13，其mRNA前体由7个外显子和6个内含子组成，具有8个常见基因多态性位点。其中3个位于TGF－β1基因5’末端启动子区域 (－988C/A、－800G/A、－509C/T)，3个位于编码区(包括第1外显子区+869T/C、+915G/C和第5外显子区+788C/T位点)，有2个是codon位点，分别为codon263和 codon327。其中+869T/C和+915G/C基因多态性位点位于第1外显子编码的信号肽蛋白序列中。TGF－β1基因的变异可导致其表达和功能异常，从而诱导多种疾病的发生。TGF－β1基因特定的单核苷酸多态性(Single Nucleotide Polymorphism，SNP)位点的基因型可能可以作为个体遗传特性的标记，参与相关疾病的发生。

子痫前期是由遗传、环境及免疫等诸多因素共同作用的临床常见病和多发病。TGF－β1是一种多功能的细胞因子，最近研究表明，它可调节血脂水平，参与炎症过程，而且发现它及其受体在动脉粥样硬化(Atherosclerosis，AS)纤维斑块和纤维脂肪性损伤区中呈现高水平表达，提示TGF－β1在AS的发病机制中可能发挥着重要作用，KANAE等［18］研究证实TGF－β1基因变异与AS明显相关。而胎盘组织中的动脉粥样硬化是子痫前期的重要病理改变，提示TGF－β1的基因变异可能与子痫前期的易患性有关。

我们对广东地区汉族人群中156例子痫前期患者和252例正常妊娠者进行了TGF－β1基因多态性分析，研究结果显示:TGF－β1+869T/C存在基因多态性。TGF－β1+869T/C位点由C和T两种等位基因组成三种基因型，即TT型、CT型和CC型，+869T/C位点基因型分布和基因频率在子痫前期患者与健康对照人群间存在显著差异，CC/CT基因型发生子痫前期的危险性显著高于非携带者(p＜0.01)，C等位基因携带者发生子痫前期危险性显著高于T等位基因者(p＜0.01)，Logistic回归分析显示:C等位基因携带者发生子痫前期相对危险性RR值为1.815，95% 可信区间(95%CI)为 1.214～2.713，提示TGF－β1+869T/C多态性位点CC/CT基因型和C等位基因与广东地区汉族人群子痫前期发生的遗传易感性相关。DE LIMA T H等［19］研究显示－509C/T位点多态性与子痫前期发生相关，CT基因型和T等位基因携带者患子痫前期的危险性增加，RR值为1.29。而KIM等［20］研究显示TGF－β1－509T/C位点与子痫前期发生无相关性，而与+869T/C位点多态性相关。上述结果提示不同种族人群子痫前期的发生，可能与TGF－β1基因中不同的多态性位点及其不同的基因型或等位基因有关，说明基因多态性存在种族遗传差异，不同种族和地区人群可能由不同的位点变异构成子痫前期发生的危险因素。TGF－β1+869T/C位点可能是中国广东地区汉族人群子痫前期发生的危险因子。

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