天麻饮片分级的研究

仲瑞雪，钟 恋，万 军，周 霞*，吴纯洁*

(1.成都中医药大学，四川成都 611137;2.西南交通大学生命科学与工程学院，四川成都 610031)

天麻为兰科植物天麻 Gastrodia elata Bl.的干燥块茎［1］，又名赤箭，主产于陕西、四川、贵州、云南等地［2］。天麻性平、味甘，归肝经，具有熄风止痉、平肝潜阳的功能［3-4］，主要用于治疗头痛、眩晕等症［5-7］。天麻素为其主要的活性物质，具有镇痛、降压、解痉等药理作用［8-14］。目前仅天麻药材有等级划分，而饮片分级标准尚不完善［15］。课题组针对目前市场上天麻饮片等级划分模糊，划分标准不完善等问题，开展天麻饮片等级的研究，现报道如下。

1 材料与仪器

1.1 材料 本研究所用药材为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎，生长期为2～4年，家种，冬麻，样品采收时间为2011年10月至2011年12月，分别购于陕西汉中、四川绵阳、贵州毕节，每批采样10 kg。药材经西南交通大学生命科学与工程学院宋良科教授鉴定为兰科植物天麻Gastrodia elata Bl.的干燥块茎，并委托四川新荷花中药饮片有限公司加工为饮片，样品保存于西南交通大学生物工程实验室。天麻素对照品(中国药品生物制品检定所，批号110807-200205)。乙腈、甲醇均为色谱纯，其余试剂为分析纯。

1.2 仪器 岛津LC-2010A高效液相色谱仪(日本岛津公司);Sartorius BP 211D电子天平(感量0.1 mg、0.01 mg;载量210 g、80 g;德国赛多利斯公司);Autoscience AS 5150A超声波清洗器(天津奥特赛恩斯仪器有限公司);电热式恒温水浴锅(江苏金坛宏凯仪器厂)，色谱柱Global chromatography C18(250 mm×4.6 mm，5μm，苏州环球色谱有限责任公司);实验统计软件为SPSS 17.0。

2 方法与结果

2.1 天麻饮片等级调研 课题组成员对四川绵阳平武县、贵州毕节大方县、陕西汉中略阳县、宁强县的天麻基地及产地中药饮片厂进行了调研。结果显示，国内天麻药材分级仍沿用1984年的《七十六种药材商品规格标准》按每公斤支数划分等级，对天麻饮片的分级概念却比较模糊，大多数饮片厂并没有对饮片进行分级，只有在客户有分级要求时，才对天麻饮片进行分级加工。

2.2 天麻饮片片型测定 课题组共采集了12批样品。每批样品选择300个样本进行测量，测定结果见表1。

表1 天麻饮片样品片型测定结果(n=300)Tab.1 Sheet-type measurement results of Gastrodiae Rhizoma pieces(n=300)

由表1可见，各样品中片型大小由大到小排序，纵片S1=S2＞S3=S4＞S5=S6;横片 S7＞S10＞S11=S12＞S8=S9。

2.3 天麻饮片水分、浸出物测定 按2010年版《中国药典》一部附录水分、总灰分、浸出物测定方法测定，平行测定3份，结果见表2。

表2 天麻饮片样品水分、总灰分、浸出物测定结果(n=3)Tab.2 Moisture，total ash and extract measurement results of Gastrodiae Rhizoma pieces(n=3)

由表2可见，各样品中含水量高低排序为S8＞S12＞S2＞S7＞S1=S3＞S11＞S4＞S10＞S5＞S6＞S9，总灰分高低排序为S5=S10＞S6=S11=S12＞S2＞S3=S7=S9＞S4=S8＞S1，75%乙醇浸出物高低排序为S3=S9＞S4=S5=S6＞S8＞S7＞S2＞S1＞S11＞S12＞S10。

2.4 天麻饮片中天麻素测定［1］

2.4.1 色谱条件 Global chromatography C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm);流动相为乙腈-0.05%磷酸水溶液(3∶97);体积流量1.0 mL/min;柱温25℃;检测波长220 nm;进样量5μL。理论板数按天麻素峰计算应不低于5000。

2.4.2 对照品溶液的制备 精密称取在80℃减压干燥1 h的天麻素对照品适量，精密称定，加流动相制成每1 mL含50μg的溶液，即得。

2.4.3 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约2 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，称定质量，加热回流3 h，放冷，再称定质量，用稀乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密量取续滤液10 mL，浓缩至近干，残渣加乙腈-水(3∶97)混合溶液溶解，转移至25 mL量瓶中。用乙腈-水(3∶97)混合溶液稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.4.4 线性关系 精密称取天麻素对照品50 mg，置100 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，作为对照品溶液;再分别精密吸取对照品溶液1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，作为标准曲线溶液。按上述色谱条件进样测定。以峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标绘制标准曲线。回归方程Y=1.49×106X+28847.64，r=0.9999，天麻素进样量在0.2～2.0μg范围内与峰面积呈线性关系。

2.4.5 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品(样品1～12)溶液各5μL，注入液相色谱仪，结果见图1，按“2.4.1”项下色谱条件测定，按干燥品计算，结果见表3。

由表3可见，各样品中天麻素含有量高低为S4＞S3＞S6=S5＞S2＞S1＞S7＞S9＞S8＞S12＞S11＞S10。

2.5 天麻饮片指纹图谱研究［16-20］

2.5.1 供试品溶液制备 取本品粉末(过三号筛)约4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇50 mL，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

图1 天麻素对照品(A)及12批天麻饮片(B)的HPLC图谱Fig.1 HPLC chromatograms of Gastrodiae Rhizoma pieces for reference(A)and twelve samples(B)

表3 天麻饮片样品中天麻素测定结果(n=3)Tab.3 Gastrodin assay results of Gastrodiae Rhizoma pieces(n=3)

2.5.2 参照物溶液的制备 取天麻素对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL含100μg的溶液，即得。

2.5.3 色谱条件 Global chromatography C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm);以0.4%磷酸水溶液为流动相A，乙腈为流动相B，按表4中的规定进行梯度洗脱;体积流量为1 mL/min;检测波长为270 nm;柱温25℃;进样量10μL。

2.5.4 方法学考察

2.5.4.1 精密度试验 取同一批天麻样品，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测，连续进样6次，以天麻素峰(4号峰)作为参照峰，指纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.38%～1.03%和0.41% ～2.92%，均小于3%，表明仪器精密度良好。

表4 梯度条件Tab.4 Gradient conditions

2.5.4.2 稳定性试验 取同一批天麻样品，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测，分别在0、2、4、6、8、12 h不同时间点进行检测，以天麻素峰(4号峰)作为参照峰，指纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.38%～1.45%和0.79% ～2.88%，表明样品在12 h内基本稳定。

2.5.4.3 重复性试验 取同一天麻样品6份，按上述供试品溶液制备方法和色谱条件进行检测，以天麻素峰(4号峰)作为参照峰，指纹图谱中各特征峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD分别在0.20%～0.66%和1.46% ～2.86%。表明本方法重复性良好。

2.5.5 对照指纹图谱的建立及共有峰的确定 将12批天麻样品，按“2.5.1”项下方法制备供试品溶液，按以上色谱条件测定。采用国家药典委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A版)，以中位数生成指纹图谱共有模式，共确定11个共有峰，结果见图2、3。

图2 天麻饮片指纹图谱共有模式图Fig.2 Common fingerprints mode of Gastrodiae Rhizoma pieces

图3 12批天麻饮片指纹图谱叠加图Fig.3 HPLC fingerprints of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces

2.5.6 共有指纹峰的相对保留时间及相对峰面积在所建立的色谱条件下，天麻各样品的特征峰均有较好的分离，保留时间较为稳定，同时11个特征峰均能稳定出现，以天麻素(4号峰)为S峰，计算特征峰的相对保留时间和相对峰面积，结果见表5、6。

2.5.7 相似度分析 采用《国家药典》委员会中药色谱指纹图谱相似度评价系统软件(2004A

版)，以生成的指纹图谱共有模式为对照计算各批次样品的相似度，结果见表7。

表5 12批天麻饮片指纹图谱的相对峰面积Tab.5 Relative peak areas of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces fingerprint

表6 12批天麻饮片指纹图谱的相对保留时间Tab.6 Relative retention time of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces fingerprint

表7 12批天麻饮片指纹图谱的相似度Tab.7 Sample similarity calculation results of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces

由表7可知，按样品相似度可将样品分三类，S3～S6为Ⅰ类，相似度在0.93以上，S1～S2为Ⅱ类，相似度在0.91至0.93之间，其余为Ⅲ类，相似度在0.7以下。

2.5.8 聚类分析 以各样品共有峰的相对峰面积值为变量，利用SPSS 17.0聚类分析法，采用组间距离法，欧氏距离平方作为测度，对12批样品进行分类，结果见图4。

图4 12批天麻指纹图谱聚类分析Tab.4 Cluster analysis of 34 batches of 12 batches of Gastrodiae Rhizoma pieces

由上图可以得出，聚类分析结果大致将样品分为三类，S3～S6为Ⅰ类，S1～S2为Ⅱ类，其余样品为Ⅲ类。根据指纹图谱相似度分析和聚类分析，聚类趋势与相似度计算结果基本一致，两种方法的结果得到了相互验证。

3 结果

3.1 现有分类法的矛盾 本研究中12个样品按片型大小排序，最大为S1、S2、S7，最小为S8、S9;按水分含有量高低排序，最高为S8，最低为S9;按总灰分含有量高低排序，最高为S5、S10，最低为S1;按浸出物含有量高低排序，最高为S3、S9，最低为S10;按天麻素含有量高低排序，最高为S4，最低为S10。经调研，现有天麻饮片分级方法单纯采用片型大小来划分，可能会出现较大片型直接被划分为市场一级饮片而其水分、总灰分、浸出物、天麻素含有量并不是最优，如S1、S2、S10市场等级都是一级，水分含有量分别为11.2%、11.4%、10.8%，总灰分含有量分别为2.3%、2.6%、2.8%，浸出物含有量分别为 16.7%、16.9%、13.9%，天麻素含有量分别为0.71%、0.73%、0.22%，均不是最优。因此，如只按饮片大小划分等级，可能会出现外在质量与内在质量不统一的矛盾。目前，天麻饮片分级还没有统一的行业标准。

3.2 “三步分级法”划分天麻饮片等级 为解决上述矛盾，同时结合市场实际情况，课题组创新采用“三步分级法”(以下简称“三步法”)确定饮片标准，即“一步定统货、二步定一级、三步定优级”，结合天麻饮片具体分级方法如下。

3.2.1 第一步 按照药典方法对样品进行检查，符合药典标准的样品均划为统货。实验共收集12个样品，均检验合格，暂定为统货。

3.2.2 第二步 采用传统分级方法，即根据天麻饮片长径进行选优，分出统货和一级及以上。实验共收集12个样品，结合市售天麻饮片实际情况，2个样品划为统货，其余10个样品定为一级及以上。

3.2.3 第三步 在传统分级方法的基础上，进一步考察天麻素含有量、75%乙醇浸出物量、指纹图谱聚类分析及相似度等内在指标，从10个样品选优，共筛选出优级样品4个，其余6个样品定为一级。

3.3 统计方法对饮片等级的验证 运用SPSS 17.0软件对“三步法”分出的不同等级的天麻饮片作Kruskal-Wallis H检验，结果显示，水分P=0.313，P＞0.05，总灰分的P=0.485，P＞0.05，可认为统货、一级和优级的水分、总灰分含有量没有差异，不能作为分级指标。75%浸出物的P=0.014，P＜0.05，天麻素含有量的P=0.023，P＜0.05，指纹图谱相似度结果P=0.011，P＜0.05，指纹图谱聚类分析结果一级和优级天麻有差异，可认为一级和优级的75%乙醇浸出物含有量、天麻素含有量、指纹图谱有差异，可作为分级指标。

统计结果表明，采用“三步法”对天麻饮片分等级可行，具有可操作性及实际应用价值。

4 结论

根据实验结果及“三步法”划分等级，12批市售天麻饮片，S8，S9划分为统货，S1，S2，S7、S10、S11、S12划分为一级，S3～S6划分为优级。分级流程见图5。

5 讨论

本研究结果表明，市场上只按天麻饮片大小分级的方法可能欠妥，课题组提出采用“三步法”划分饮片等级，该方法兼顾了饮片的外在质量和内在质量，为饮片分级提供了一种新方法。按“三步法”划分的优级天麻饮片均来自于道地产区(陕西汉中)，说明“三步法”在区分道地性方面有一定适用性。但影响道地性的因素较多，例如栽培环境、采收加工等，因此“三步法”在区分道地性方面是否具有普适性，还需扩大样本进一步考察。本实验所述“三步法”包括的检查项目有限，在此基础上还可增加薄层色谱鉴别、多糖含有量等指标进一步完善分级标准，该方法对市场天麻饮片分级具有一定的参考意义。下一步还应扩大饮片种类及样本量，进一步验证“三步法”的可行性。

图5 天麻饮片分级流程图Tab.5 Classification flow chart of Gastrodiae Rhizoma pieces

［1］国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010年版一部［S］.北京:中国医药科技出版社，2010:54-55.

［2］康延国.中药鉴定学［M］.北京:中国中医药出版社，2003:237-239.

［3］金 虹，李 凤，段 宁.天麻提取物工艺及其功效成分含量的分析［J］.中药材，2009，32(5):799-802.

［4］陶云海.天麻药理研究新进展［J］.中国中药杂志，2008，33(1):108-110.

［5］岑信钊.天麻的化学成分与药理作用研究进展［J］.中药材，2005，28(10):958-961.

［6］缪化春，沈业寿.天麻多糖的降血压作用［J］.高血压杂志，2006，14(7):531-534.

［7］孔小卫，柳听义，关 键.天麻多糖对亚急性衰老模型小鼠自由基代谢的影响［J］.安徽大学学报:自然科学版，2005，29(2):95-98.

［8］徐金章，杨水新.天麻饮片中天麻素的含量测定方法的研究［J］.中成药，2001，23(11):795-797.

［9］肖 薇，尹 珉，庄志宏，等.不同产地天麻中天麻素含量的测定［J］.北京中医药，2011，30(12):945-946.

［10］吴春敏，陈海滨.天麻中天麻素含量测定方法的研究［J］.中国中药杂志，2004，29(12):1157-1159.

［11］何 晶.天麻素的药理作用及临床应用［J］.天津药学，2006，18(5):62-63.

［12］Jung J W，Yoon B H，Oh H R，et al.Anxiolytic-like effects of Gastrodia elata and its phenolic constituent in mice［J］.Biol Pharm Bull，2006，29(2):261-265.

［13］Yu S J，Kim J R，Lee C K，et al.Gastrodia elata Blume and an active component，p-hydroxybenzyl alcohol reduce focal ischemic brain injury through antioxidant related gene expressions［J］.Biol Pharm Bull，2005，28(6):1016-1020.

［14］Ha J H，Lee D U，Lee J T，et al.4-Hydroxybenzaldehyde from Gastrodia elata B1.is active in the antioxidation and GABAergic neuromodulation of the rat brain［J］.J Ethnopharmacol，2000，73(1/2):329-333.

［15］国家中医药管理局，中华人民共和国卫生部.七十六种药材商品规格标准［S］.1984.

［16］石上梅，孙 婕，杜庆鹏，等.天麻药材HPLC指纹图谱的研究［J］.中国药学杂志，2005，40(10):739-741.

［17］田 静，许亚玲，舒 娟，等.梵净山仿野生天麻高效液相指纹图谱研究［J］.中成药，2011，33(9):1472-1475.

［18］王 莉，程孟春，肖红斌，等.天麻液相色谱指纹图谱研究［J］.中草药，2006，37(9):1402-1405.

［19］Xie P，Chen S，Liang Y Z，et al.Chromatographic fingerprint analysis—a rational approach for quality assessment of traditional Chinese herbal medicine［J］.J Chromatogr A，2006，1112(1/2):171-180.

［20］Ma Taotao，Huang Cheng，Meng Xiaoming，et al.Fingerprint analysis of Hawk-tea by high-performance liquid chromatography［J］.Food Chem，2011，129(2):551-556.