6 种中药活性成分对 K562/ADM 耐药性逆转及 P27 和 P170 蛋白表达影响

陈 超， 蔡天革， 张荣华， 杨 丽， 蔡 宇*

（1.暨南大学附属第一医院， 广东 广州 510630； 2.辽宁大学生命科学学院，辽宁 沈阳 110036；3.暨南大学药学院， 广东 广州 510632）

［药 理］

6 种中药活性成分对 K562/ADM 耐药性逆转及 P27 和 P170 蛋白表达影响

陈 超1， 蔡天革2， 张荣华3， 杨 丽3， 蔡 宇3*

（1.暨南大学附属第一医院， 广东 广州 510630； 2.辽宁大学生命科学学院，辽宁 沈阳 110036；3.暨南大学药学院， 广东 广州 510632）

目的 观察中药活性成分对白血病 K562/ADM耐药细胞逆转及 P27 和 P170 蛋白表达的影响， 探讨其可能作用机制。方法 选用补骨脂素、 苦参碱、 槲皮素、 姜黄素、 川芎嗪、 大黄酸6种中药单体成分作为研究对象， MTT比色法测定 6 种中药成分对 K562/ADM耐药细胞的增殖抑制作用， 高效液相色谱法检测细胞内阿霉素的质量浓度， 流式细胞术检测 K562/ADM耐药细胞中 P27 和 P170 蛋白表达。 结果 6 种中药活性成分逆转耐药倍数在 6.99 ～10.59 之间，K562/ADM耐药细胞中阿霉素积累比率为 （11.6 ±3.7） ～ （17.7 ±2.8）； 对照组 P27 和 P210 蛋白的表达率分别为（33.1 ±2.1） 和 （6.51 ±1.33）， K562/S 和 K562/ADM耐药细胞的 P27 和 P210 相关蛋白表达率分别在 （54.2 ±3.5）～ （72.1 ±4.2） 和 （6.21 ±1.35） ～ （ 6.59 ±1.48） 之间。 结论 6 种中药活性成分具有不同程度的逆转耐药细胞作用， 且影响耐药细胞内化疗药物质量浓度； 各中药活性成分具有不同程度抑制 K562/ADM耐药细胞中 P27 蛋白表达作用。

补骨脂素； 苦参碱； 槲皮素； 姜黄素； 川芎嗪； 大黄酸； K562/ADM耐药细胞； P27； P170； 蛋白表达

化学药物是治疗白血病方法之一，但由于白血病细胞的耐药性，常限制化疗疗效，并导致治疗失败。白血病药物多药耐药机制形成较复杂，目前虽探讨较多但还 未 完全明晰［1-3］； 本 实 验选用 K562/ ADM耐药细胞株为研究对象， 开展中药活性成分对其耐药逆转影响评价以及其对耐药细胞内化疗药物浓度影响，探索其对耐药细胞 P27 和 P170 蛋白表达影响以说明其作用机制。

1 实验材料

选取白血病 K562/S （敏感株） 和 K562/ADM（耐药阿霉素 K562 细胞株）， 购买于中山大学实验动物中心； 小牛血清及 RPMI-1640 培养液由 GIBCO公司出品， 批号 20120320； 破膜液 A和 B由北京阜康生物科技股份有限公司生产，批号20120122。 选择 6 种中药活性成分 （补骨脂素、 川芎嗪、苦参碱、姜黄素、槲皮素、大黄酸）做为实验受试物， 受试物纯度 99.9%， 于中国食品药品检定研究院购买的对照品。参考以往实验结果和报道受试物的使用质量浓度为 30 μg/mL［4-5］。

2 实验方法

2.1 各受试物对白血病细胞增殖抑制作用 对数生长期的 K562/S 和 K562/ADM耐药细胞数分别以0.5 ×105个/mL和 1 ×105个/mL接种于细胞培养板， 在 37 ℃、 5%CO2培养条件下 100 μL/孔接种12 h 后， 分别加入上述受试物和阿霉素共 100 μL，在调零组和对照组分别加相应体积的培养液，除调零组外，细胞培养 72 h 后加 5 mg/mLMTT 20 μL，再培养4 h，倾出培养液，加 DMSO 100 μL/孔， 溶解后用酶标仪 （奥地利 TZCAN公司生产） 读取吸光度 A值 （波长570 nm）， 取 A值均数按公式计算细胞抑制率， 并求出半数抑制质量浓度 （ IC50），实验重复 3 次， 逆转耐药倍数 =K562/ADM耐药株对照组 IC50/用药组 IC50。

2.2 高效液相色谱法检测细胞内阿霉素质量浓度参考文献 ［6］ 实验方法， 取对数生长期白血病K562/S 敏感株和 K562/ADM耐药细胞株， 在培养液中分别加或不加 30 μmol/L的各中药单体成分补骨脂素、苦参碱、槲皮素、姜黄素、川芎嗪、大黄酸， 再加 5 mg/L的阿霉素， 培养3 h 后收集细胞，PBS 洗涤重悬计数后置 -20 ℃冰箱保存， 测定前先溶化并超声处理， 离心 30 min， 取上清进样高效液相色谱 （ 安捷伦 1100 型）； 色谱 C18柱， 流动相为 55%乙腈， 体积流量 1 mL/min， 柱温 35 ℃， 检测波长 290 nm，取样 10 μL进样分析。 以阿霉素对照品为内标，色谱峰的峰面积对阿霉素的质量浓度进行线性回归， 其线性回归曲线为 y=0.081x+ 0.31 （r=0.996， n=5）； 细胞内阿霉素积累比率 =合用中药活性成分细胞内阿霉素质量浓度/单用阿霉素后细胞内阿霉素质量浓度。

2.3 流式细胞术测定耐药细胞 P27 和 P170 蛋白表达 采用 PBS 液重悬白血病 K562/ADM 耐药细胞， 细胞数为 1 ×106个/mL，取 50 μL细胞液加入 100 μL破膜液 A后，加入 2mL PBS， 离心后弃上清， 加 100 μL破膜液 B及 RD公司抗体 P27（SC-1641） 和 AB-CAM公司 P170 抗体 （110917）5 μL， PBS 液 洗涤 离 心 后加 入 5 μL FITC标 记 二抗， 反 应 15 min 后 PBS 液 洗 涤 离 心， 450 μL 1%多聚甲醛固定 30 min 后， 上 机流式细 胞 仪 （ 美 国BD公司） 检测。

3 实验结果

3.1 各受试物对白血病 K562/ADM耐药的细胞毒作用 6 种受试中药活性物的质量浓度为 30 μg/mL， 与阿霉素合用对白血病 K562/ADM耐药株的 IC50在 45.6 ～69.9 ng/mL之间， 相应 K562/S敏感株的 IC50在 4.7 ～7.9 ng/mL范围， 实验结果见下表1。

表1 受试物的细胞毒作用Tab.1 Cytotoxicity of each trail drug

3.2 各受试物对 K562/ADM耐药细胞内阿霉素质量浓度和 P27、 P170 蛋白表达影响 各受试物对K562/ADM耐药细胞的逆转倍数在 6.99 ～10.59 之间， K562/ADM 耐 药 细 胞 中 阿 霉 素 积 累比 率 在（11.6 ±3.7） ～ （17.7 ±2.8） 之间；对照组 P27和 P210 蛋白表达率百分比分别为 （33.1 ±2.1） 和（6.51 ±1.33），相应 K562/ADM耐药细胞 P27 和P210 相 关 蛋 白 表 达 率 分 别 为 （54.2 ±3.5） ～（72.1 ±4.2） 和 （6.21 ±1.35） ～ （ 6.59 ±1.48）之间， 结果见表2 ～4。

表 2 各中药成分对 K 562/ADM 耐药细胞内阿霉素积累比率和逆转倍数影响Tab.2 Influence of herb's active constituents on accumulation and reversal rates of adriam ycin in K562/ ADM strain

表 3 各中药成分对 K 562/ADM 耐药细胞内 P27 蛋白表达影响Tab.3 Influence of herb's active constituents on K562/ ADM cells and exPression of P27

表 4 各中药成分 对 K562/ADM 耐药 细 胞内 P170 蛋白表达影响Tab.4 Influence of herb's active constituents on K562/ADM drug resistance strain and exPression of P170

4 讨论

白血病细胞对化疗药物的多重耐药是导致化疗失败的常见因素，目前认为多种作用机制是白血病细胞多重耐药形成原因， 包括细胞膜 P-糖蛋白 （P-gP）、多药耐药相关蛋白 （MRP） 过度表达形成药物外输泵， 使化疗药物在白血病细胞内浓度下降［7-9］。

近年来，细胞信号传导通路成为多重耐药形成机制研究热点， 其中 PI3K/Akt（phosphatidylinositol-3’ kinase/Akt） 是体内重要的信号转导通路之一，在维持细胞的正常生理功能如生长、分化、代谢等方面起着关键作用， PI3K/Akt与肿瘤的 发生有些密切的关系，其中在某些白血病细胞中其表现为持续性 的 活化［10-11］。 PI3K/Akt信 号通路的 激 活可引起一系列的生物效应，如凋亡效应、调节细胞周期、 促进侵袭和转移、 促进血管形成等， PI3K/ Akt信号通路主要通过磷酸化作用激活，活化的Akt还与细胞周期有关， 活化的 Akt使 P27 蛋白表达迅速下降， P27 蛋白是 CDK2 （ cyclin-de-pendent kinase2） 的抑 制 剂， 是一种细 胞 周 期调 节 激 酶，在调节细胞 进 入 S 期 中起 抑 制 作用［12-13］；本 实 验数据表明， K562/ADM 耐药细胞 P27 蛋白表达较K562/S 明显降低， 同时各受试物能提高 P27 蛋白的表达率，因而也提示各受试物具有逆转耐药作用可能通过影响 PI3K/Akt信号转导途径而达到的。

P170 是多药耐药基因产物， 是多药耐药基因编码的跨膜蛋白，是导致细胞产生多重耐药的原因之一， 具有 ATP酶活性及其转运功能， 可将化疗药物从细胞内排出，达到细胞内化疗浓度降低，改善白血病细胞对化疗药物耐药［14］， 本研究结果中K562/ADM耐药细胞的 P170 高表达， 说明了 P170对耐药形成的意义； 通过不同受试物对 K562/ADM耐药细胞的 P170 蛋白表达率影响结果看，苦参碱、姜黄素和川芎嗪各组与对照组比较具有非常显著性差异 P＜0.01， 而其他几种受试物对 K562/ADM耐药细胞的 P170 蛋白影响不明显，同时与耐药逆转作用呈非正相关，就 P170 蛋白表达是否为其作用机制因素之一还有待今后进一步深入分析。

本实验是以往就补骨脂素、补骨脂甲素、姜黄素、槲皮素、大黄酸等中药活性成分对 K562 和 HL-60白血病细胞及其耐药细胞影响的确切结果基础上开展的［2，15］， 以往的结果给本实验提供了剂量依据，本实验也进一步开展了其他中药活性成分研究，实验结果也提示了具有逆转耐药作用的不同中药活性成分对 P27 和 P120 蛋白影响规律并不完全一致， 该结果对探索不同中药活性成分对 PI3K/Akt信号通路影响及其作用靶点和机制研究提供基础，其具体其他可能机制有待进一步研究探讨说明。

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Influences of six herbal constituents on Protein exPressions of P27 and P170 and reversal of K 562/ADM cells

CHEN Chao1， CAITian-ge2， ZHANG Rong-hua3， YANG Li3， CAIYu3*
（1.The First Affiliated Hospital to Jinan University， Guangzhou 510630， China； 2.School of Life Science of Liaoning University， Shenyang 110036，China； 3.School of Pharmacy of Jinan University， Guangzhou 510632， China）

AIM To observe the influence of six herbal constituents， including psoralen，matrine， quercetin，curcumin igustrazine and rhein， on leukemia K562/ADM cells reversion and P27 and P170 protein expressions. M ETHODS MTT colorimetric was used to determine proliferation inhibition of six constituents on K562/ADM cells.HPLCmethod was used to detect the concentration ofadriamycin in the cells， and flow cytometrywasapplied to detecting P27 and P170 protein expression of K562/ADM cells.RESULTS The reverse ratio of drug resistance fell within 6.99 to 10.59， adriamycin accumulation in K562/ADM cells in multiples of（ 11.6 ±3.7 ） ～（17.7 ±2.8）， and P210 and P27 protein expression rate of control groups reached （33.1 ±2.1） and （6.51 ± 2.1）.K562/S， K562/ADM cells’ P27 and P210 related protein expression rates were in the range of（54.2 ± 3.5）to（72.1 ±4.2）and （6.21 ±1.35） to（6.59 ±1.48）.CONCLUSION Six herbal constituents have different abilities to reverse drug resistant cell function， to influence on chemotherapy drug concentration in the cell，and to inhibit P27 protein expression in K562/ADM.

psoralen；matrine； quercetin； curcumin igustrazine；rhein； K562/ADM； P27； P170； protein expression

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0001-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.001

2013-02-19

国家自然科学基金资助 （81072763）

陈 超 （1972—）， 男， 硕士， 主治医师， 从事中药药效基础与临床研究。

*通信作者： 蔡 宇 （1972—） ， 男， 博士， 教授， 从事肿瘤多药耐药研究。 E-mail： caitiange@163.com