益髓生血颗粒特定指纹图谱及特征峰分析

孙玉雯，刘起华，文 谨，吴志奎

(中国中医科学院广安门医院，北京 100053)

中药是典型的复杂体系，具有多组分与多靶点的特点，在目前对其临床疗效了解较多而作用机制尚未完全明了的情况下，仅以某一指标性成分的定性或定量来评价中药的质量是不全面的［1］。中药指纹图谱是一种综合的、可量化的质量控制手段，其基本属性是整体性和模糊性［2-4］，这与中医理论的整体性原则和中药作用机制的模糊性是相对应的，因此指纹图谱已成为国际公认的控制中药和天然药物质量的最有效手段［5-6］。

益髓生血颗粒具有滋阴补肾、益髓生血、补气健脾之功效，是吴志奎教授根据中医肾生髓、髓生血理论，以补肾益髓法创制的具有我国自主知识产权的、唯一用于治疗地中海贫血的中药制剂。本课题组依托多项国家课题和基金的资助，在我国广西南宁地中海贫血高发区开展临床研究近30年，取得肯定的可重复的临床疗效［7-10］。该药由山茱萸、何首乌等11味中药组成，成分复杂，目前对该药的质量评价方法仅有薄层色谱法，标准亟待提高。为确保该品种的质量稳定、可控，本研究建立了益髓生血颗粒的UPLC指纹图谱，并对其共有峰进行了定性鉴别和药材归属分析，以实现多成分评价益髓生血颗粒质量的方法，为探索其治疗地中海贫血的药效物质基础提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器 Waters Acquity H-Class UPLC超高效液相色谱仪(四元梯度泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器以及Empower 2工作站)、Acquity UPLC BEH C18色谱柱(50 mm×2.1 mm，1.7μm)(美国Waters公司);电子分析天平(德国Sartorius公司)。

1.2 试剂 甲醇、磷酸(均为分析纯，北京化学试剂公司);乙腈(色谱纯，Fisher Chemical公司，4 L);屈臣氏蒸馏水。

1.3 样品 实验用的益髓生血颗粒系中国中医科学院广安门医院制剂中心生产提供(批号为110124、 110506、 110519、 110602、 110612、110801、111012、111207、120405、120516，编号为S1～S10)深褐色颗粒，每1 g药粉相当于2.36 g生药。

1.4 对照品及药材

1.4.1 对照品 马钱苷(批号111640-200604)、二苯乙烯苷(批号 110844-200607)、补骨脂素(批号 110739-200613)、异补骨脂素(批号110738-201012)、芒丙花素(批号111703-200501)、大黄素(批号110756-200110)、槲皮素(批号 100081-200406)、大黄素甲醚(批号110758-200610)、没食子酸(批号110831-200302)均购自中国药品生物制品检定所。

1.4.2 药材 山茱萸、制何首乌、熟地黄、炙黄芪、党参、当归、补骨脂、鸡血藤、阿胶、鳖甲、砂仁均购自本草药材公司，经药剂科刘起华老师鉴定均为《中国药典》各项下规定的药材品种。

2 方法与结果

2.1 供试品溶液的制备 取益髓生血颗粒1 g，碾碎，精密称量，置100 mL具塞锥形瓶中，精确加入30 mL甲醇，密塞，称定质量，超声提取30 min，取出冷至室温，擦净瓶外壁，称定质量，用提取溶剂补足失质量，摇匀，滤过，滤液过微孔滤膜，即得供试品溶液。

2.2 对照品溶液的制备 取对照品，精密称定，加甲醇制成对照品溶液，再精密吸取没食子酸(0.226mg/mL)0.25mL、马 钱 苷(0.226 mg/mL)0.8 mL、二苯乙烯苷(0.202 mg/mL)0.5 mL、槲皮素(0.182 mg/mL)0.1 mL、补骨脂素(0.13 mg/mL)0.5 mL、异补骨脂素(0.176 mg/mL)0.5 mL、芒柄花素(0.083 mg/mL)0.1 mL、大黄素(0.159 mg/mL)0.1 mL、大黄素甲醚(0.196 mg/mL)0.2 mL于10 mL的量瓶中，加甲醇定容至刻度，摇匀，微孔滤膜滤过，滤液作为混合对照品溶液。

2.3 对照药材溶液的制备 取方中山茱萸、制何首乌、熟地黄、炙黄芪、党参、当归、补骨脂、鸡血藤、阿胶、鳖甲、砂仁药材，按益髓生血颗粒的提取工艺提取各药材，减压干燥，并按组方比例及各药材得膏率称取各药材干膏，按样品溶液的制备方法制备各对照药材的供试液。

2.4 色谱条件 柱温30℃;体积流量0.25 mL/min;进样量 3μL;流动相为乙腈(A)-0.1% 磷酸水溶液(B)梯度洗脱，0～8 min(3%～15%A)，8～18 min(15% ～45%A)，18～20 min(45% ～70%A)，20～22 min(70% ～100%A)，22～23 min(100% ～3%A)。

2.5 精密度试验 精密吸取同一供试品溶液(批号110801)，连续重复进样6次，按“2.4”项下色谱条件进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对6次测定结果进行计算，其相似度均为0.99以上。以12号峰(补骨脂素)为对照峰S，考察6次测定的色谱中各共有峰的相对保留时间及相对ln(峰面积)比值的一致性，结果显示两者的RSD值均小于3%，整个检测系统的精密度良好，符合指纹图谱的要求。

2.6 稳定性试验 取同一供试品溶液(批号110801)，分别在0、2、4、8、12、24 h按 “2.4”项下条件进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对6次测定结果进行计算，其相似度均为0.99以上。以12号峰(补骨脂素)为对照峰S，考察6次测定的色谱中各共有峰的相对保留时间及相对ln(峰面积)比值的一致性。各共有峰的相对保留时间及相对ln(峰面积)的RSD值均小于3%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.7 重复性试验 取益髓生血颗粒(批号110801)共6份，分别按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下条件进行检测，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对6次测定结果进行计算，其相似度均为0.99以上。以12号峰(补骨脂素)为对照峰S，考察6次测定的色谱中各共有峰的相对保留时间及相对ln(峰面积)比值的一致性。各共有峰的相对保留时间及相对ln(峰面积)的RSD值均小于3%，表明本方法的重复性良好。

2.8 指纹图谱的建立 取10批益髓生血颗粒，按“2.1”项下方法制备供试品溶液，并按“2.4”项下条件进行检测，记录色谱图，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)对10批供试品的色谱图进行比较分析，选择吸收信号较强、稳定性好、重复性好、峰形明显的16个色谱峰标定为共有峰(图1)。

图1 10批益髓生血颗粒样品UPLC色谱图Fig.1 UPLC characteristic chromatograms of ten batches of samples

采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统(2004A版)，将10批样品数据导入该软件，对选定的16个特征峰进行多点校正，自动匹配，得到益髓生血颗粒对照指纹图谱，各批益髓生血颗粒样品的UPLC图谱与对照指纹图谱比较，并计算其相似度，结果表明益髓生血颗粒样品整体相似度为0.800～1.000，不同批号之间的成分基本一致(表1)。

表1 10批益髓生血颗粒样品相似度评价结果Tab.1 Results of similarities evaluation for ten batches of Yisui Shengxue Granules

选择色谱峰稳定、重复性好的12号峰(补骨脂素)为对照峰S，对其特征峰的保留时间和相对ln(峰面积)进行比较统计分析。从结果看，各共有峰的保留时间RSD值为0～0.34%，小于1%，不同批次的药品同一位置特征峰的保留时间较为稳定，16个特征峰都能稳定出现。但其相对ln(峰面积)的RSD值高达70%以上，这一结果说明，各批样品的16个特征峰所对应的成分量相差较大，这一结果进一步解释上述与对照图谱比较，相似度偏低的原因，造成这一现象的原因可能是该制剂前期的质量标准仅有薄层鉴别，导致原药材质量控制不够严格，提示我们应注重提高该药质量控制的监管手段，尽量保证药品的质量稳定。

2.9 益髓生血颗粒样品中共有峰的归属分析

2.9.1 对照品对照分析 取益髓生血颗粒样品以及“2.2”项下的混合对照品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进行检测，通过保留时间与UV光谱的对照分析，确定了各峰的归属，具体见图2。

图2 益髓生血颗粒指纹图谱与各对照品的色谱比较图Fig.2 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and compound standard

2.9.2 益髓生血颗粒样品中共有峰的药材归属分析 取益髓生血颗粒及“2.3”项下组方药材的供试品溶液，按“2.4.3”项下色谱条件进行检测，以保留时间和UV光谱确认各共有峰的来源(图3)。可以看出，其中1～5、8号峰来自山茱萸，1、3、7、9、15、16号峰来自何首乌，来自君药的色谱峰共10个，占总色谱峰的62.5%;2、3号峰来自熟地黄，6、7、12、13号峰来自补骨脂，8、10、11、14号峰来自黄芪，2号峰来自党参，2、8号峰来自当归，来自臣药的色谱峰共10个，占总色谱峰的62.5%，10、14号峰来自鸡血藤，来自佐药的色谱峰共2个，占总色谱峰的12.5%。在当前的色谱条件下，阿胶、鳖甲样品中无相应色谱峰被检出，砂仁没有色谱峰显示在共有模式中。

图3 益髓生血颗粒与单味药材UPLC色谱图比较Fig.3 Comparison of UPLC characteristic chromatograms of Yisui Shengxue Granules and single Chinese medicine

3 讨论

地中海贫血是世界范围内发病率高、危害大的单基因遗传病，西方医学尚无确切有效的治疗方法［11］。益髓生血颗粒是目前唯一用于治疗该病的中药制剂，本课题组多年的疗效机制研究显示，该药通过修饰、调节基因表达和基因产物功能，获得无副作用和后遗症的显著疗效［12-15］。为了更好地控制益髓生血颗粒质量，探讨其药效物质基础，本实验开展了该药指纹图谱的研究。研究初期，曾用普通的高效液相色谱仪检测，分析样品用时达80 min，本实验所采用的UPLC方法，灵敏度高，同样的梯度洗脱系统，其用时仅为普通液相色谱的四分之一，且该色谱方法性能稳定，具有可重复性。

在确定的色谱条件下，比较10批样品的色谱图，建立了益髓生血颗粒甲醇提取物的UPLC指纹图谱，标定了16个共有峰，通过对照品比对，确定其中9个色谱峰分别为没食子酸、马钱苷、二苯乙烯苷、槲皮素、补骨脂素、异补骨脂素、芒柄花素、大黄素、大黄素甲醚。通过与各单味药材样品色谱图的比较，基本确定16个共有峰的药材归属为:来自君药山茱萸和何首乌共10个，占总色谱峰的62.5%;来自臣药熟地黄、黄芪、党参、当归、补骨脂共10个峰，占总色谱峰的62.5%，来自佐药的色谱峰共2个，占总色谱峰的12.5%。

10批益髓生血颗粒色谱峰中16个共有峰的相对保留时间和相对峰面积的计算比较显示，不同批号之间的成分基本一致，各共有峰的出峰时间稳定，但各批样品中共有峰所对应的化合物的量波动较大。这可能是因为原药材的产地、炮制加工的差别所致，提示应当提高原药材检查的力度，尽量固定药材来源，优化生产工艺，保证药品的质量稳定。

本实验结果使益髓生血颗粒中尚不明确的各个成分由无序到有序，各个色谱峰的归属明确，来源清晰，并确定其中9种成分，对于已知成分可进行定量测定，通过未知成分的相对保留时间与相对峰面积等参数，可以较为客观地评价益髓生血颗粒的内在质量，同时也为进一步开展其该药进入体内成分研究、药效物质基础的确定以及配伍规律的解析等奠定了基础。

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