新疆不同产地红花质量评价

刘雅新，刘珊珊，谭 勇，陈 文

(新疆特种植物药资源教育部重点实验室，新疆石河子 832002)

红花为菊科植物红花Carthamus tinctorius L.的干燥管状花，味辛性温，归心、肝经，具有活血通经、散瘀止痛的功效［1］。红花化学成分复杂，主要含有查尔酮类色素、黄酮类、酚酸类、甾体类及多糖类等化合物［2-5］。由于红花独特的药理作用［6-8］，目前国内外对红花的需求量日益增加，而新疆红花的种植面积和产量占全国的80%［9］，因此控制新疆红花药材的内在质量［10］以及发展新疆红花道地药材的生产已成为当务之急，而有关新疆不同产地红花质量评价的文献目前还没有报道。本实验对新疆32批不同产地的红花质量进行了系统的分析与评价，采用《中国药典》“红花”项下有效成分检测指标为标准，测定并比较新疆不同产地红花中羟基红花黄色素A与山柰素的量，同时对10批新疆不同产地红花进行了HPLC指纹图谱的对比研究，旨在为评价新疆不同产地红花的质量提供科学依据，为筛选出优良的红花产地和实施GAP奠定重要基础。

1 仪器与材料

LC-20AT高效液相色谱仪(日本岛津公司);Sartorius BP211D十万分之一分析天平(北京赛多利斯仪器系统有限公司);Sartorius分析天平(北京赛多利斯天平有限公司);CF-16RX高速离心机(日本日立科学仪器有限公司)。

羟基红花黄色素A对照品(中国药品生物制品检定所，批号111637-200503);山柰素对照品(中国药品生物制品检定所，批号110861-200606);红花样品(产地新疆);甲醇、乙腈为色谱纯;磷酸为分析纯;蒸馏水与双蒸水(实验室自制)。

2 方法与结果

2.1 羟基红花黄色素A的测定［1］

2.1.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为甲醇-乙腈-0.7%磷酸水溶液(26∶2∶72);检测波长403 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;进样量20μL。

2.1.2 对照品溶液的制备 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加25%甲醇制成0.51 mg/mL的溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备 取红花粉末(过三号筛)0.4 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入25%甲醇50 mL，称定质量，超声处理(功率300 W，频率50 kHz)40 min，放冷，再称定质量，用25%甲醇补足减失的质量，过滤，取续滤液，即得。

2.1.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按上述方法进行测定，色谱图见图1，羟基红花黄色素A测定结果见表1。

图1 羟基红花黄色素A(A)对照品和红花样品(B)的HPLC色谱图Fig.1 HPLC chromatograms of hydroxysafllor yellow A(A)and safflower sample(B)

表1 新疆不同产地红花中羟基红花黄色素A和山柰素Tab.1 Hydroxysafllor yellow A and kaempferide content in safflower from different habitats in Xinjiang

2.2 山柰素的测定［1］

2.2.1 色谱条件 Agilent C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为甲醇-0.4%磷酸水溶液(52∶48);检测波长367 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;进样量20μL。

2.2.2 对照品溶液的制备 取山柰素对照品适量，精密称定，加甲醇制成0.08 mg/mL的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备 取红花粉末0.5 g，精密称定，置锥形瓶中，加入甲醇25 mL，称定质量，加热回流30 min，放冷，再称定质量，用甲醇补足减失质量，滤过，取续滤液15 mL，置平底烧杯中，加盐酸溶液(15→37)5 mL，摇匀，置水浴中加热水解30 min，立即冷却，转移至25 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，滤过，取续滤液，即得。

2.2.4 样品测定 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各20μL，注入液相色谱仪，按上述方法进行测定，色谱图见图2，山奈素测定结果见表1。

2.3 新疆不同产地红花HPLC指纹图谱的建立［11-15］及对比研究

2.3.1 色谱条件 C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5μm);流动相为乙腈(A)-0.5%磷酸水溶液(B)，梯度洗脱(0 min，5%A;55 min，25%A;65 min，5%A);检测波长275 nm;体积流量1.0 mL/min;柱温30℃;进样量20μL。

图2 山柰素对照品(A)和红花样品(B)的HPLC色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of kaempferide(A)and safflower sample(B)

2.3.2 对照品溶液制备 取羟基红花黄色素A对照品适量，精密称定，加水制成2.50 mg/mL的溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液制备 取红花粉末(过三号筛)0.4 g，加入水50 mL，称定质量，超声处理(功率250 W频率59 kHz)60 min，放冷再称定，补足减失质量，滤过，取续滤液，即得。

2.3.4 精密度试验 取同一份红花样品的供试品溶液连续进样5次，按“2.3.1”项色谱条件检测指纹图谱。以羟基红花黄色素A为参比峰，考察各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的一致性，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD均在3%以下，表明仪器精密度良好，符合指纹图谱的检测要求。

2.3.5 重复性试验 取同一批红花样品5份，按供试品溶液的制备方法分别制备供试品溶液，按“2.3.1”项色谱条件检测，以羟基红花黄色素A为参比峰，计算共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，各共有峰的相对保留时间和相对峰面积值的RSD均在3%以下，表明该方法具有较好的重复性。

2.3.6 稳定性试验 取同一份红花样品作为供试品溶液，分别于0、4、8、12、24 h检测指纹图谱，以羟基红花黄色素A为参比峰，计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积，结果表明，共有峰的相对保留时间和相对峰面积值的RSD均在3%以下，表明样品溶液在24 h内稳定，符合指纹图谱检测要求。

2.3.7 新疆不同产地红花指纹图谱的建立 在同一个色谱条件下，对收集的10批新疆不同产地红花进行测定，比较各样品的HPLC指纹图谱(图3)，得20个共有特征峰(图4)，因此确定这20个峰为共有指纹峰。

图3 10批新疆不同产地红花HPLC指纹图谱Fig.3 Fingerprint graphics of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

图4 新疆红花指纹图谱特征峰Fig.4 Fingerprint characteristic peak of safflower sample from different habitats in Xinjiang

2.3.8 新疆不同产地红花指纹图谱相似度评价由32批新疆不同产地红花中羟基红花黄色素A与山柰素的测定结果可知，塔城、伊犁、昌吉、和田与喀什地区内羟基红花黄色素A与山柰素的量相差不大，但不同地区之间有明显差异，因此分别选择2批塔城、伊犁、昌吉、和田与喀什地区的红花样品，测定10批新疆不同产地的红花药材，记录指纹图谱，并采用“计算机辅助相似度评价系统”软件(2004A)进行数据处理，10批新疆不同产地红花药材的相似度均在0.95以上(见表2)。

2.3.9 样品主成分聚类分析 本实验采用已建立的红花药材指纹图谱色谱条件，对10批新疆不同产地的红花药材进行了指纹图谱聚类判别分析，将各色谱峰相对峰面积与样品号建立矩阵，应用SPSS 19.0软件，采用组间均联法，以欧氏距离为测度，得到红花药材的聚类谱系图(图5)。由聚类分析结果图可以看出，10批新疆不同产地红花共聚为四个大类。其中北疆昌吉地区木垒县东城镇与北疆昌吉地区奇台县半截沟镇为一类，南疆和田洛浦县山普鲁乡与南疆和田策勒县策勤乡为第二类，南疆喀什叶城县铁提乡与南疆喀什英吉沙县城关乡为第三类，北疆塔城地区164团、北疆塔城地区多拉特乡、北疆伊犁地区果子沟与北疆伊犁地区察县四乡为第四类。

表2 10批新疆不同产地红花指纹图谱间的相似度Tab.2 Similarity analysis of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

图5 10批新疆不同产地红花聚类分析结果图Fig.5 Hierarchical clustering result of 10 batches safflower samples from different habitats in Xinjiang

3 讨论

3.1 由32批产自新疆不同地区的红花样品中羟基红花黄色素A的测定结果可知，大部分产地红花样品中羟基红花黄色素A的量高于药典标准，昌吉地区红花样品的羟基红花黄色素A量最高，和田地区红花样品的羟基红花黄色素A量最低，其中和田策勤县红花样品的羟基红花黄色素A量仅为0.93%，低于国家药典标准，北疆地区红花样品的羟基红花黄色素A量高于南疆地区红花样品。因此，在选择红花的种植区域时，因考虑种植地区对红花有效成分的影响，由此可知，昌吉地区可作为红花的最佳种植区域。

3.2 由32批产自新疆不同地区的红花中山柰素的测定结果可知，昌吉地区红花样品山柰素的量最高，和田地区红花样品的山柰素量最低，低于国家药典标准，北疆产地红花样品中山柰素量高于南疆产地样品。由以上结果可知，昌吉地区可作为种植红花的最佳区域。

3.3 根据10批不同产地红花样品指纹图谱的相似度评价结果可知，本实验收集的新疆不同产地红花主要峰群整体图貌基本一致，共有峰相对保留时间基本一致，所含的主成分基本相似，而不同产地红花的相对峰面积差异较大，其中昌吉地区的相对峰面积最大，和田地区的相对峰面积最小，说明不同产地的环境、气候等因素对红花药材中各种成分的量有较大影响。

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