白花丹参提取物对脂多糖损伤内皮祖细胞周期与凋亡的影响

焦 鹏， 杨娜娜， 唐瑜菁， 秦树存

（ 泰山医学院 动脉粥样硬化研究所， 山东 泰安 271000）

白花丹参提取物对脂多糖损伤内皮祖细胞周期与凋亡的影响

焦 鹏， 杨娜娜， 唐瑜菁， 秦树存*

（ 泰山医学院 动脉粥样硬化研究所， 山东 泰安 271000）

目的 探讨白花丹参提取物对脂多糖损伤内皮祖细胞周期与凋亡的作用。 方法 以 10 μg/mL脂多糖诱导内皮祖细胞损伤， 制备内皮祖细胞损伤模型后用不同质量浓度白花丹参提取物干预， 用 MTT比色法检测各组细胞活性，用 AnnexinV/PI双染法检测细胞凋亡变化， 碘化丙啶单染流式细胞仪检测各组细胞周期。 结果 与正常对照组比较，模型组细胞增殖活性明显下降， 细胞凋亡率明显增加， S 期细胞比率降低， G0/G1期细胞比率增加。 与模型组比较，白花丹参组细胞存活率升高， 细胞凋亡率下降， 且呈剂量依赖性， G0/G1期细胞比率降低， S 期及 G2/M期细胞比率均增加。结论 白花丹参对脂多糖损伤的血管内皮祖细胞有保护作用，其机制可能是通过保护细胞周期正常进行、抑制细胞凋亡实现的。

白花丹参；内皮祖细胞；细胞周期；凋亡；增殖

我国近年来动脉粥样硬化的发病率呈现逐年上升和年轻化趋势［1］。血管内皮细胞功能受损是导致动脉粥样硬化形成的始动环节，保护血管内皮功能是防治动脉粥样 硬化的 重要手 段之一［2-3］。 内皮祖细胞是血管内皮细胞的前体细胞，亦称为成血管细胞，在生理或病理因素刺激下，可从骨髓动员到外周血参与损伤血 管的修 复［4-5］。丹参是唇 形科鼠尾草属植物，是治疗心脑血管病的常用中药，其活性成分主要包括脂溶性和水溶性两大类，这两类成分在动脉粥样硬化发生的各个阶段均具一定作用［6］。本研究所使用的白花丹参采自泰山，属稀有罕见的名贵中药材，是丹参族中的极品。本实验拟在脂多糖致血管内皮祖细胞损伤模型上研究白花丹参水溶性提取物对受损内皮祖细胞的影响。

1 材料

1.1 药 物 和 细 胞 白 花 丹 参 Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba采自泰山， 白花丹参提取物的制备和人脐血内皮祖细胞的培养和鉴定参照本课题组发表的文献， 即参考文献 ［7］。

1.2 试剂 EBM-2 培养基购自 Lonza公司； MTT，PI， AnnexinV/PI染色试剂盒均购自南京凯基生物科技公司； 脂多糖， DMSO购自 Sigma公司。

1.3 仪 器 流 式 细 胞 仪 （BD FACSCalibur，美国）， RE-52A型旋转蒸发仪 （上海亚荣生化仪器厂）， SHBⅢ型循环水式多用真空泵 （郑州长城科工贸有限公司）， 酶标仪 （550 型， 美国 BIO-RAD公 司 ）， 图 像 分 析 系 统 Lasersharp2000 软 件（v4.5.3， 美国 BIO-RAD公司）。

2 方法

2.1 实验分组 将体外培养的脐血内皮祖细胞随机分为3组：正常对照组不予任何处理，脂多糖损伤组用 10 μg/m L脂多糖处理 12 h 诱导内皮祖细胞损伤，白花丹参干预组用脂多糖诱导内皮祖细胞损伤后用不同质量浓度 （0.2、 0.4、 0.8 g/L） 白花丹参提取物干预12 h。

2.2 细胞活力的检测 将处于对数生长期的细胞以 1.2 ×104个/孔的密度加入 96 孔板中， 每孔 100 μL培养基， 每组设6个复孔， 生长过夜后， 分别按以上分组处理， 12 h后弃原培养基， 各孔加入含 0.5 mg/LMTT的培养液， 继续孵育 4 h 后弃上清， 每孔加 DMSO 150 μL， 充分振荡 30 min 后在490 nm测定每孔的吸光度 A值， 对结果进行统计分析。

2.3 细胞凋亡的检测 按分组处理细胞后， 分别收集各组漂浮细胞和用胰酶消化下的细胞， PBS 洗2 次，1 100 r/min离心 5 min 后去上清， 按照试剂盒的说明书进行 AnnexinV/PI染色后， 立即进行流式细胞仪检测，实验重复3次。

2.4 流式细胞仪检测细胞周期 胰酶消化实验组和对照组细胞制备单细胞悬液， 加入 75%的冰乙醇， 4 ℃ 固 定 过 夜， 1 100 r/min 离 心 5 min， 细 胞用 PBS 洗 2 次后加入 10 μg/mL的 RNaseA， 37 ℃作用 30 min，加 入 10 μg/mL的 碘 化 丙 啶 染 料， 4℃闭光染色 30 min 后上机检测， 用 CellQuest软件获取细胞后用 Modifit软件分析各组细胞的周期分布， 分 析 G0/G1期、 S 期 和 G2/M 期 细 胞 所 占比例［8］。

3 结果

3.1 内皮祖细胞的活力检测 不同质量浓度白花丹参提取物对脂多糖损伤后内皮祖细胞活力的影响见图 1。 结果显示， 10 μg/m L脂多糖作用内皮祖细胞后，细胞活力受到明显的抑制，不同质量浓度白花丹参干预后细胞活性高于单纯损伤组，白花丹参提取物质量浓度在 0.8 g/L时达到最大效应（图1）。

图1 内皮祖细胞的活力检测Fig.1 Endothelial Progenitor cells viability test

3.2 内皮祖细胞的凋亡检测 内皮祖细胞的凋亡通过流式细胞仪 AnnexinV-FITC/PI染色法来检测。结果 如 图 2， AnnexinV-FITC/PI凋亡检测结 果 表明，没有经过处理的内皮祖细胞只有一小部分细胞发生凋亡， 而 10 μg/mL脂多糖与内皮祖细胞孵育12 h 后能明显诱导细胞凋亡， 而 0.8 g/L白花丹参处理后能明显抑制脂多糖引起的细胞凋亡 （图2）。

3.3 内皮祖细胞的周期检测 流式细胞仪检测不同分组处理后内皮祖细胞的 DNA水平揭示了内皮祖细胞周期分布的变化。 如图 3， 10 μg/m L脂多糖处理细胞后， G0/G1期细胞比率较正常对照组明显增加， S 期细胞百分比低于对照组 （P＜0.01）。因此，脂多糖对内皮祖细胞生长的抑制作用可能是通过 G0/G1期阻滞来实现的。 与模型组比较， 白花丹参组细胞 G0/G1期细胞比率降低， S 期及 G2/M期细胞比率均增加，0.8 g/L白花丹参处理后，S期细胞比率与模型组比较有显著差别，且白花丹参提取物高、 低质量浓度药物组的 G0/G1期与正常对照组差异无统计学意义 （P＞0.05）。 见流式细胞仪 PI染色 DNA倍体分析结果 （图 3A） 及统计分析结果 （图 3B）。

图 2 流式细胞仪 AnnexinV-PI双染检测内皮祖细胞的凋亡率Fig.2 Flow cytom etry Annexin V-PI double staining detected aPoPtosis of endothelial Progenitor cells

图3 流式细胞仪 PI染色不同分组处理后内皮祖细胞的周期分布Fig.3 PI staining flow cytometry detection of different grouPs of endothelial Progenitor cycle distrihution

4 讨论

从学术角度分析，内皮祖细胞的概念虽然提出仅仅十几年，但研究进展迅速，业已证明内皮祖细胞在血管内皮系统保护和损伤修复中发挥关键作用［9-10］。本课题组的前期工作已经证明氧化低密度脂蛋白可以损伤内皮祖细胞的功能，而新近有文献报道丹参提取物可以提升外周血中内皮祖细胞的数量［11］。国内研究发现丹参对高胆固醇血症患者外周血内皮祖细胞数量无显著影响但显著提高内皮祖细胞的功能， 但其机制尚不清楚［12］。 因此， 丹参对心血管系统的保护作用，可能部分地与增加了内皮祖细胞数量、提高其功能有关，极有可能亦促进内皮祖细胞的损伤修复功能［13］。

丹参中水溶性的活性成分主要为酚酸类化合物， Chan 等研究发现， 在丹参水提物修复内皮细胞功能失调的过程中，不同类型的成分表现出较大差异，水提物的作用效果优于丹参素、原儿茶酸等化学单体［14-15］。 本研究 在前期 研究工作的基础上，在动脉粥样硬化的独立危险因素之一脂多糖致血管内皮祖细胞损伤模型上，进行拓展性研究，评价动脉粥样硬化的危险因素存在下白花丹参对受损内皮祖细胞的保护作用。本实验观察到泰山白花丹参水提物在 MTT实验中所获得的最强药效浓度下对脂多糖 （10 μg/mL）诱导的内皮祖细胞凋亡具有明显的抑制作用而且对脂多糖造成的细胞周期阻滞现象有明显改善作用，为白花丹参发展为血管保护药物提供新的实验数据和理论依据。由于中药在使用过程中多以复合物而非纯品的形式存在，丹参在体内可能涉及到多种成分的相互作用，因此多种丹参成分之间的协同作用机制在动脉粥样硬化治疗过程中具有更加重要的意义。

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Effect of Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract on cell cycle and aPoPtosis of endothelial Progenitor cells injured by LPS

JIAO Peng， YANG Na-na， TANG Yu-jing， QIN Shu-cun*
（Institute of Arteriosclerosis， Taishan Medical College， Taian 271000， China）

Salviamiltiorrhiza Bunge.f.alba；endothelial progenitor cells； cell cycle； apoptosis； proliferation

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0022-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.006

2013-03-18

山东省中医药科技发展计划项目 （2011-228）； 山东省自然科学基金 （Z2008C03）； 国家自然科学基金 （30971098）； 山东省自然科学基金 （ZR2012HL18）

焦 鹏 （1979—） ， 女， 讲师， 硕士， 研究方向： 细胞生物学。 Tel： 13854826934 E-mail： jiaopeng196@163.com

*通信作者：秦树存，教授，研究方向：脂质代谢与动脉粥样硬化。

ABSTRACT： AIM To explore the effect of Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extracton the cell cycle and apoptosis of endothelial progenitor cells injured by lipopolysaccharide（ LPS）.METHOD The injury to endothelial progenitor cellswas induced by 10 μg/mL LPS and Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract had been intervening in endothelial progenitor cells.Changes of cellular morphology were detected with microscope.The viability of the cells in each group was examined by MTT method.Flow cytometry Annexin V/PI staining was used for apoptotic changes and PI staining for analysis of the effect of the cell cycle.RESULTS Compared with the control group，LPSdecreased the proliferative activity and increased the rate of cell apoptosis.Flow cytometry PIstaining showed there weremore cells arrested atG0/G1stage and less cells at S stage in LPSdamage group，rather the other way around in Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extract group.CONCLUSION Salvia miltiorrhiza Bunge.f.alba extractmay have significant protective effect on the endothelial progenitor cells injured by LPS and related to the protection of normal cell cycle and the decrease in the cell apoptosis.