中华眼镜蛇神经毒素的活性研究

高红瑾，许云禄，王少明，陈 燕

(1.福建医科大学省立临床学院，福建省立医院，福建 福州350001;2.福建医科大学蛇毒研究所，福建 福州350004;3.福建中医药大学药学系，福建福州350108)

眼镜蛇神经毒素(Neurotoxin，NT)是中华眼镜蛇毒中最主要的致死成分，也是最主要的镇痛成分。本实验通过NT对醋酸，热板及电刺激三种药理模型的研究，探讨了江西产眼镜蛇神经毒素的镇痛作用，并通过其对离体蛙腹直肌N2受体的阻断作用，了解其毒性，对于毒素的产品开发以及作用机理的研究有重要意义。

1 材料和方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验药物 江西产中华眼镜蛇神经毒素NT(电泳纯)，由福建医科大学蛇毒研究所提供。

1.1.2 实验动物 普通级KM小鼠，雌雄兼用，体重18～22 g，由吴氏实验动物中心提供，动物合格证号:SCX(闽):20042002;牛蛙，市售。

1.1.3 试剂 硫酸罗通定注射液(广东省博罗先锋药业集团有限公司，批号:080606);氯乙酰胆碱(国药集团化学试剂有限公司，批号:20080603);盐酸哌替啶注射液(宜昌人福药业有限责任公司，批号:2120503);维库溴铵注射液(扬子江药业集团有限公司，批号:13071711);其他试剂均为国产分析纯。

1.1.4 主要仪器 RM6240B/C型生物信号采集处理系统，JTC－1型交流电刺激器(成都仪器厂)，HSS－1型恒温浴槽(成都仪器厂)，JZ101型肌肉张力换能器(北京市朝阳区信达机电技术研究所)。

1.2 方法

1.2.1 NT量效关系的测定(热板法) 小鼠热板法［1］取体重18～22 g，12 h禁食不禁水的雌性 KM小鼠，将小鼠放在(55±0.5)℃的恒温金属板上，记录小鼠从放置热板上到出现舔后足反应的时间，测两次取平均值作为给药前基础痛阈值，将基础痛阈不在5～30 s范围内的小鼠剔除，取75只符合要求小鼠，随机分为5组，每组15只，分为中华眼镜蛇神经毒素大剂量组(NT 0.160 mg·kg－1)、中剂量组(NT 0.120 mg·kg－1)、小剂量组(NT 0.060 mg·kg－1)、罗通定组(Rot 50 mg·kg－1)，生理盐水对照组(NS 10 mL·kg－1)。各组均腹腔注射，分别测定NT大剂量组，中剂量组，小剂量组，生理盐水组腹腔注射后4 h的痛阈，罗通定组测定给药后2 h的痛阈。痛阈超过60 s按60 s计。计算痛阈提高百分率。

痛阈提高百分率=［(给药后痛阈值－给药前痛阈值)/给药前痛阈值］×100%

1.2.2 NT时效关系的测定 参照小鼠热板法，选取合格的KM雌性小鼠30只随机分成两组，每组15只，分别腹腔注射NT 0.12 mg·kg－1和生理盐水0.1 mL·(10 g)－1，测定给药前和给药后 1、2、3、4、5、6 h各时间点小鼠的痛阈值，计算痛阈提高百分率。

1.2.3 小鼠电刺激法观察NT的镇痛作用 取18～22 g的KM小鼠，给药前先进行动物筛选，将小鼠装入鼠筒并使其尾巴露出，将交流电刺激仪“刺激方式”调至“单次”，刺激时间置于0.6 s，输出端的两个鳄鱼夹用生理盐水润湿，然后分别夹住小鼠尾巴近心端和远心端，调整电压旋钮至1 V，开通电源，逐渐增加电压，以引起小鼠嘶叫电压值为基础痛阈，基础痛阈＞5 V者弃用。将合格的小鼠30只，雌雄各半，随机分成3组，分别腹腔注射生理盐水［NS 0.1 mL·(10 g)－1］，哌替啶(Dol 50 mg·kg－1)，神经毒素(NT 0.12 mg·kg－1)如超过50 V 仍无反应者，其痛阈按50 V计。测定给药前，NT组，NS组给药后5 h小鼠痛阈，Dol组测定给药后1 h痛阈，并计算痛阈提高百分率。

1.2.4 小鼠醋酸扭体法［1］观察NT镇痛活性 KM雌性小鼠33只，体重18～22 g，随机分成3组，生理盐水组(NS 10 mL·kg－1)、罗痛定组(Rot 50 mg·kg－1)和神经毒素组(NT 0.120 mg·kg－1)，参照文献方法，NS组、NT组腹腔注射给药5 h后，Rot组腹腔注射给药1 h后，每只小鼠按10 mL·kg－1剂量腹腔注射0.8%醋酸，观察15 min内小鼠的扭体次数，并计算抑制百分率。抑制百分率=［(生理盐水组扭体次数－实组扭体次数)/生理盐水组扭体次数］×100%。

1.2.5 NT对乙酰胆碱所致蛙体外腹直肌收缩作用的影响 开启RM6240生物信号采集处理系统，参数分别设定为“肌张力，扫描速度10 s·div－1，灵敏度3 g”。参照文献方法［2］制备标本，置于盛有任氏液10 mL的浴槽中，通以空气，标本加前负荷1.5～3 g，稳定10 min，以累加法向浴槽内加入乙酰胆碱描记标本收缩曲线，直至标本收缩幅度不再随ACh浓度的增加而增加即达最大效应。用任氏液冲洗标本3次，待收缩曲线恢复到基线后，加入NT作用15 min后，同法加入ACh描记NT存在时标本收缩曲线，以ACh终浓度的对数值为横坐标，效应百分率为纵坐标，绘出ACh引起标本收缩的量效曲线，求出给NT前后ACh引起蛙腹直肌收缩的半数最大有效浓度(EC50和EC50*)，根据 Schild［3］公式计算 NT对N2－AChR的解离常数。EC50

*/EC50－1=I/KD(I:拮抗剂的浓度，KD:解离常数)

同法计算维库溴铵(vecuronium bromide，Vec)的解离常数。

2 结果

2.1 NT镇痛量效关系(热板法)结果表明腹腔NT 0.12 mg·kg－1，0.16 mg·kg－1后4 h 小鼠热板痛阈明显提高，痛阈分别提高94.91%和116.77%，与生理盐水组比较有显著差异，见表1。

2.2 NT镇痛时效关系(热板法) 结果表明腹腔注射 NT 0.12 mg·kg－1后，2 h 痛阈提高 41.13%，与生理盐水组比较有显著性差异(P＜0.05)，5 h痛阈达到最高峰，比基础痛阈提高118.09%(P＜0.01)，见表2。

表1 NT镇痛量效关系(热板法)(n=15，±s)

表1 NT镇痛量效关系(热板法)(n=15，±s)

注:与 NS组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与给药前比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 剂量 小鼠热板痛阈(s)15.34 ±4.14 17.96 ±6.58 0.06 mg·kg－1 17.49 ±5.95 25.84 ±13.35#NT 0.12 mg·kg－1 16.32 ±6.00 31.81 ±17.31*##0.16 mg·kg－1 16.64 ±4.38 36.07 ±19.78*##Rot 50 mg·kg－1 18.12 ±6.70 45.97 ±17.63＊＊##给药前 给药后NS 0.1 mL·kg－1

2.3 NT对电刺激致痛的镇痛作用实验结果 结果表明腹腔注射NT后，1 h痛阈与NS组比较无显著差异而5 h小鼠的痛阈提高526.32%，与生理盐水组比较有显著差异(P＜0.05)，与Dol组比较起效慢而维持时间长，见表3。

表2 NT的镇痛时效关系(热板法)(n=15，±s)

表2 NT的镇痛时效关系(热板法)(n=15，±s)

注:与 NS 组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与给药前比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 剂量 给药前痛阈(s)给药后痛阈(s)0 17.96 ±6.58 19.38 ±8.03 19.74 ±7.80 NT 0.12 mg·kg－1 16.32 ±6.00 22.01 ±7.76# 23.03 ±7.55*# 28.10 ±10.81＊＊##31.81 ±17.31*## 35.58 ±16.20＊＊## 35.39 ±17.85*##1 h 2 h 3 h 4 h 5 h 6 h NS 0.1 mL·(10 g)－115.54 ±4.14 17.15 ±8.61 16.31 ±5.98 16.59 ±8.0

表3 NT的镇痛活性(电刺激法)(n=10，±s)

表3 NT的镇痛活性(电刺激法)(n=10，±s)

注:与 NS 组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与给药前比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 剂量 基础痛阈(V)给药后痛阈(V)2.10 ±0.88 1.80 ±0.63 1.90 ±0.74 Dol 50 mg·kg－1 2.10 ±1.10 5.70 ±1.64＊＊##3.40 ±1.27 NT 0.12 mg·kg－1 2.80 ±1.23 5.30 ±3.50 11.90 ±6.97*#1 h 5 h NS 0.1 mL·(10 g)－1

2.4 NT对醋酸致痛的镇痛作用结果 结果表明腹腔注射NT后5 h，小鼠扭体次数明显减少，见表4。

表4 NT对小鼠扭体次数的影响(n=11，±s)

表4 NT对小鼠扭体次数的影响(n=11，±s)

注:与 NS组比较，*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01;与给药前比较，#P ＜0.05，##P ＜0.01

组别 剂量 扭体次数 抑制率(%)47.50 41.73 ±12.13 0 Rot 50 mg·kg－1 18.82 ±6.91＊＊ 54.90 NT 0.12 mg·kg－1 21.91 ±4.66＊＊NS 0.1 mL·(10 g)－1

2.5 NT对蛙腹直肌N2受体的阻断作用 结果表明NT可使ACh所致的蛙腹直肌收缩的量效曲线平行右移，见图1。用Log(EC50*/EC50－1)对 NT摩尔浓度的负对数作图，其斜率接近－1，见图2。NT浓度为 1 ×10－7mol·L－1，3.2 ×10－7mol·L－1时，KD 值分别为(5.05 ± 0.27)× 10－2μmol·L－1和(5.20 ±0.93)×10－2μmol·L－1，改变 NT 的浓度其KD值基本不变，NT的KD值取均值5.12×10－2μmol·L－1;Vec 的 KD 值为(3.30 ±0.23)×10－1μmol·L－1，两者比值 3.30 × 10－1/5.12 × 10－2=6.45，说明 NT同 N2受体的亲和力约为 Vec的6.45倍。

3 讨论

图1 NT对ACh所致蛙离体腹直肌收缩的影响(n=3)

图2 不同浓度NT与Log(EC50*/EC50－1)的关系

3.1 本实验对NT的镇痛作用进行观察，结果表明NT具有较明显的镇痛活性，对不同的致痛模型显示了对抗作用，具有剂量－效应关系。NT的镇痛作用起效较慢，腹腔注射后2 h起效，5 h达到作用高峰。

3.2 不同的测痛方法所观察的痛反应区中枢整合部位有所不同［4］。本实验观察到NT对电刺激引起的疼痛效果最好，对醋酸诱发的扭体反应，对热板所致疼痛效果次之。热板法舔爪的反应在低位脑干和脊髓水平进行整合，但电刺激小鼠嘶叫反应涉及大脑边缘系统等间脑的整合部位，可以推测，NT的镇痛活性可能涉及脑内较高的整合部位。蛇毒的镇痛机制是十分复杂可能涉及胆碱能系统［5，6］、NO/cGMP/PKG 信号转导通路［7～9］、巨噬细胞活性［10］和内源性阿片系统［8，11～13］，说明各种蛇毒中存在着许多具有镇痛作用的不同组分，需要我们进一步去研究。

3.3 突触后神经毒素与ACh竞争N2－AChR的结合位点，是N2－AChR的竞争性拮抗剂，可使ACh腹直肌收缩的量效曲线平行右移。突触前神经毒素对N2－AChR无作用，所以对外源性ACh所致的蛙腹直肌收缩的量效曲线无影响。本实验通过离体蛙腹直肌实验的研究，NT使ACh所致的蛙腹直肌收缩的量效曲线平行右移，证明NT是突触后神经毒素。

3.4 神经毒素可引起中毒动物和人的呼吸肌麻痹和惊厥，NT由于阻断N2胆碱受体，抑制神经－肌肉接头的冲动传导而致呼吸抑制，这可能与其对N2胆碱受体很强的拮抗能力相关。突触后神经毒素与乙酰胆碱以及受体的抗体相比，具有更高的亲和力，它们三者的结合位点相互重叠但并不完全一样，因此突触后神经毒素能与乙酰胆碱竞争乙酰胆碱受体，并可以阻断乙酰胆碱所传递的神经信号，从而影响机体的正常生理功能［13］。

［1］魏伟，吴希美，李元建.药理实验方法学［M］.第4版.北京:人民卫生出版社，2010:770－774.

［2］林默君，倪秀雄.医学机能学实验［M］.北京:科学出版社，2009:91－92.

［3］杨世杰.药理学［M］.北京:人民卫生出版社，2001:16.

［4］Abbott FV，Melzack R.Brainstem lesions dissociate neural mechanisms of morphine analgesia in different kinds of pain［J］.Brain Res，1982，251(1):149 － 155.

［5］Zhang Y，Zhang L，Wang F，et al.Activation of M3 muscarinic receptors inhibits T－type Ca2+channel currents via pertussis toxin－sensitive novel protein kinase C pathway in small dorsal root ganglion neurons［J］.Cell Signal，2011，23(6):1057 －1067.

［6］Zhang L，Zhang Y，Jiang D，et al.Alpha － cobratoxin inhibits T－type calcium currents through muscarinic M4 receptor and Gomicron－protein betagamma subunitsdependent protein kinase A pathway in dorsal root ganglion neurons［J］.Neuropharmacology，2012，62(2):1062－1072.

［7］Pu XC，Wong PT，Gopalakrishnakone P.A novel analgesic toxin(hannalgesin)from thevenom ofkingcobra(Ophiophagus hannah)［J］.Toxicon，1995，33(11):1425－1431.

［8］Picolo G，Giorgi R，Cury Y .delta－ opioid receptors and nitric oxide mediate the analgesic effect of Crotalus durissus terrificus snake venom［J］.Eur J Pharmacol，2000，391(1－2):55－62.

［9］Gutierrez VP，Zambelli VO，Picolo G，et al.The peripheral L－arginine－nitric oxide－cyclic GMP pathway and ATP－sensitive K+channels are involved in the antinociceptive effect of crotalphine on neuropathic pain in rats［J］.Behav Pharmacol，2012，23(1):14 －24.

［10］Lima TS，Cataneo SC，Iritus AC，et al.Crotoxin，a rattle snake toxin，induces a long－ lasting inhibitory effect on phagocytosis by neutrophils［J］.Exp Biol Med(Maywood)，2012，237(10):1219 －1230.

［11］Konno K，Picolo G，Gutierrez VP，et al.Crotalphine，a novel potent analgesic peptide from the venom of the South American rattlesnake Crotalus durissus terrificus［J］.Peptides，2008，29(8):1293 －304.

［12］王晓辉，王化丽，李旭.尖吻蝮蛇蛇毒中镇痛成分的研究［J］.中国生化药学杂志，2001，22(4):198 －199.

［13］邓海霞，李其斌.银环蛇咬伤中毒发病机制和治疗的研究进展［J］.蛇志，2008，20(1):35－46.