HPLC法测定银蓝通络口服液总黄酮醇苷

李 添，苏建会，陈 震，何 珺*

(1.贵州省生化工程中心，贵州 贵阳550025;2.桂林红会药业有限公司，广西 灵川541200)

银蓝通络口服液以银杏叶、绞股蓝［1－4］为主药，加水煎煮，醇沉，浓缩至无醇味，加入蜂蜜制成。银杏叶主要活性成分为黄酮醇苷及萜内酯，银杏黄酮醇苷主要能够增加脑血管流量，改善脑血管循环功能，保护脑细胞，扩张冠状动脉，防止心绞痛及心肌梗塞，防止血栓形成，提高机体免疫能力。主要用于对冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年性痴呆、高血压病人的治疗［5－7］。绞股蓝，又名七叶胆、五叶参，主要成分为绞股蓝皂苷(GP)，皂苷、黄酮、多糖、氨基酸、微量元素。具有抑制肿瘤、防止衰老、降低血脂、增强免疫力、镇静止痛、保护心脏和肝脏等作用。银蓝通络口服液具有益气活血的作用，适用于头晕，心悸，疲劳等气虚血瘀证者。

银蓝通络口服液原质量标准中，对于总黄酮主要测定了其槲皮素醇苷含量，而银杏黄酮的苷元有7种，即槲皮素、山奈素、异鼠李素、杨梅素、芹菜素、木犀草素、三粒小麦黄酮，而槲皮素、山奈素、异鼠李素三种醇苷是其主要成分，因此，参考2010版中国药典采用HPLC测定银蓝通络液中槲皮素、山奈素、异鼠李素黄酮醇苷含量，该方法可以更准确测定银蓝通络口服液中总黄酮含量，从而提升银蓝通络口服液质量监测及其质量标准。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 仪器 分析型HPLC(Agilent 1100)，美国安捷伦科技公司;C18高效液相色谱柱，Hypersil ODSC18(4.6×150 mm)，大连依利特分析仪器有限公司;旋转蒸发器(RE－52A)，上海亚荣生化仪器厂;循环水式多用真空泵(SHB－Ⅲ)，郑州长城科工贸有限公司;电子天平(BAS124S)，赛多利斯科学仪器有限公司;冰箱(BCD－205)，TCL集团有限公司;电热恒温水浴锅(HH.SY21－Ni6)，北京长源实验设备厂;其他为一般常规仪器。

1.1.2 实验材料及试药 银蓝通络口服液，广西桂林红会药业有限公司提供。

对照品:槲皮素，购自中国食品药品检定研究院，批号100081－200907，纯度 ＞96.5%;山奈素，购自中国食品药品检定研究院，批号110861－201209，纯度＞93.2%;异鼠李素，购自中国食品药品检定研究院，批号110860－201109，纯度＞99%。

试剂:甲醇，高相液相色谱，天津市科密欧化学试剂有限公司;HCl，分析纯，重庆江川化工有限公司;磷酸，分析纯，贵阳高新技术开发区华通化学试剂厂;其他试剂均为分析纯。

1.2 实验方法

1.2.1 高效液相色谱条件 色谱柱:Hypersil ODS C18(4.6 mm×150 mm);流动相:甲醇∶水∶磷酸(48∶52∶0.3);流速:0.8 ml/min;检测波长:360 nm;柱温:45℃，进样量:10μL。

1.2.2 对照品溶液制备 分别精确称取经五氧化二磷干燥过夜的槲皮素、山奈素、异鼠李素对照品3.25 mg、2.96 mg、3.05 mg于100 mL容量瓶，加甲醇超声溶解并定容，摇匀，得到浓度为槲皮素∶山奈素∶异鼠李素=32.5∶29.6∶30.5μg/mL的混合对照品溶液。

1.2.3 供试品溶液的制备 样液的制备:精密量取银蓝通络口服液10 mL置锥形瓶中，加甲醇10 mL和盐酸1 mL，摇匀，回流2 h，定量转移至25 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，过0.45μm微滤后待测。

阴性对照液的制备:取药方同比例量的蜂蜜加水制成10 mL阴性对照液，按照样液制备方法，取阴性对照前液2 mL于10 mL密封水解管中，加浓盐酸1 mL，甲醇7 mL摇匀，于68℃恒温水浴密封水解3小时，取出冷却后过0.45μm微滤后，得到阴性对照液。

1.2.4 数据计算 参考2010版中国药典银杏叶提取物，总黄酮醇苷=(槲皮素+山奈素+异鼠李素)×2.51。

1.2.5 HPLC图谱

HPLC图谱见下图(图1～3)。

图1 混合对照品HPLC图谱Flg.1 HPLCchromatogram of the mixed reference substance

图2 银蓝通络口服液样品HPLC图谱Flg.2 HPLCchromatogram of Yin Lan Tong Luo Oral Liquid

图3 银蓝通络口服液阴性对照样HPLC图谱Flg.3 Negative HPLC chromatogram of Yin Lan Tong Luo Oral Liquid

由上3图可知:样品的分离度为3.75、1.62，均大于1.5，所以分离度良好。阴性对照中3个黄酮苷元峰几乎没有，因此对银蓝通络口服液中银杏总黄酮醇苷含量测定基本无干扰。

2 方法学考察

2.1 线性关系考察

精密吸取2.2对照品混合溶液2.5μL、5μL、10μL、15μL、20μL，在2.1条件下测定色谱峰面积，以峰面积积分均值对对照品溶液进样量(μg)进行线性回归(n=5)，3种组分的线性范围、回归方程和相关系数见表1，由表1可知该方法所测样品线性良好。

表1 3种组分线性范围及回归方程Tab.1 The linear range and the regression equation of three components

2.2 精密度实验

取对照品溶液重复进样5次，记录峰面积。结果表明槲皮素、山奈素和异鼠李素RSD分别为:0.26%、0.24%、0.21%，进样精密度良好。

2.3 稳定性实验

将制备好的供试样液在室温下贮存，分别于0、2、6、8、24 h进行测定，槲皮素、山奈素、异鼠李素峰面的RSD分别为1.69%、1.49%、1.39%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.4 重复性试验

取同批银蓝通络口服液样品，按2.3方法平行制备5份，在2.1条件下进行测定，结果表明槲皮素醇苷含量为1.8 mg/支，RSD为1.2%;山奈素醇苷含量为1.77 mg/支，RSD为0.41%，异鼠李素醇苷含量0.71 mg/支，RSD为1.5%，表明该供试品溶液重复性良好。

2.5 加样回收率试验

精密称取同一生产批号银蓝通络口服液样品5份，分别加入已知量的槲皮素、山奈素、异鼠李素，按照2.3方法制备后，各份分别在2.1条件下进行测定，求相同添加量的回收率(n=5)，再取其平均值为3种组分的平均回收率，分别为98.25%、94.99%、98.82%，RSD分别为1.03%、0.36%、0.80%，其结果见表2。

2.6 样品的测定

分别精密吸取对照品溶液、待测供试品溶液各10μL，按2.1色谱条件上机，以峰面积按外标法计算含量，结果如表3所示。

表2 3种黄酮组分添加回收率(n=5)Tab.2 The recovery rate of three compounds(n=5)

表3 银蓝通络口服液中总黄酮醇苷含量(mg/支)Tab.3 Ginkgo flavonoids glycol glycosides content in YIN LAN TONG LUO oral liquid

由上表可知:3批次银蓝通络口服液，且均达到槲皮素醇苷含量不少于1.1 mg/支的标准，山奈素醇苷含量在1.76～1.77 mg/支，异鼠李素醇苷含量在0.69～0.71 mg/支，总黄酮醇苷在4.24～4.29 mg/支。通过该实验方法，测定了总黄酮醇苷含量，且3个批次含量稳定。

3 总结

3.1 在对样品进行含量测定的过程中，供试品溶液需要酸水解成苷元进行检测，一般在银蓝通络口服液样液水解后12 h内检测，以免成分再分解，影响含量测定结果。

3.2 HPLC测定的流动相中加入少量醋酸或磷酸可有效改善峰形，因此，对流动相的比例进行调整后，经试验，甲醇∶水∶磷酸(48∶52∶0.3)体系可使待测组分的分离度较好。

3.3 原质量标准制定时，只测定了槲皮素醇苷的含量，现参考2010版中国药典中银杏叶提取物，通过该实验提升了银蓝通络口服液中总黄酮的质量标准，即由原来银蓝通络口服液中槲皮素醇苷不得少于1.10 mg/支，优化为测定槲皮素、山奈素及异鼠李素3种黄酮醇苷的监测 ，更准确地反应了银蓝通络口服液中药效成分总黄酮醇苷含量。

综上所述，该方法可以准确测定银蓝通络口服液中总黄酮醇苷含量，且阴性样品无干扰。同时对银蓝通络口服液中槲皮素，山奈素及异鼠李素3种黄酮醇苷进行了监测，替代原质量标准中只监测槲皮素醇苷的含量，更准确地反应了银蓝通络口服液中总黄酮醇苷含量。

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