高效液相色谱-电喷雾串联质谱法测定饲料中的N-氨基甲酰-L-谷氨酸

唐圣芸，王远兴，温平威，辛 贞

（南昌大学食品科学与技术国家重点实验室，江西 南昌 330047）

N-氨基甲酰-L-谷氨酸(N-carbamyl-L-glutamic acid)简称NCG，是一种性质稳定、安全性高的活性物质［1］。它是 N-乙酰-L-谷氨酸 (N-acetyl-L-glutamid acid，NAG)的化学结构类似物［2］，结构式见图1。已有关于NCG在食品动物生产和人类健康方面的深入研究［3］，发现其可广泛用作仔猪饲料添加剂，以替代或部分替代Arg［4］。Arg是仔猪的必需氨基酸，极易缺乏，在饲料中添加量较大，成本高，且会干扰 Trp、Lys和 His等其他氨基酸的代谢［5］。而NCG可作为Arg的代谢激活剂，促进Arg内源合成，从而促进幼龄动物的生长和发育，其所用剂量低且效果显著，同时避免了对其他氨基酸的干扰［6］。

作为一种潜在的理想饲料添加剂，目前还没有建立对饲料中NCG的检测方法，为符合饲料添加剂安全使用规范和使用剂量，有必要建立一种检测方法。根据 NCG 的化学结构，可采用核磁共振［7，8］和高效液相色谱法［9，10］鉴定和检测含量。由于配合饲料中的成分多且基质复杂，本研究小组［5］前期采用柱前衍生-高效液相色谱法分析NCG时发现基质干扰大，分离度比较差。另外，由于NCG的紫外吸收弱，直接采用紫外检测响应度低，灵敏度低［11］。高效液相色谱-电喷雾串联质谱(HPLC-ESI-MS/MS)可克服这些不足［12，13］。因此，本文采用 HPLC-ESIMS/MS对饲料中的NCG含量进行了测定。

图1 (a)N-氨基甲酰-L-谷氨酸和(b)N-乙酰-L-谷氨酸的结构式Fig.1 Structures of(a)N-carbamyl-L-glutamic acid and(b)N-acetyl-L-glutamic acid

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 6430液相色谱-三重四极杆质谱联用仪，配有电喷雾离子源(ESI)(美国Agilent公司)；涡轮振荡器(太仓市华利达实验设备有限公司)；高速离心机(湖南赫西仪器装备有限公司)；超声提取仪(昆山市超声仪器有限公司)；固相萃取仪(广州智真生物科技公司)等。

NCG标准品(纯度98%)购于Sigma公司；分析纯甲醇、三氯甲烷、正己烷、25%(v/v)氨水溶液均由国药集团化学试剂有限公司生产；色谱纯甲酸、甲醇，纯度均大于99.9%，购自 Merck KGaA公司；超纯水由Milli-Q超纯水仪(Millipore公司)制备。色谱柱Unimicro C18(Unimicro Technologies公司)；混合型强阴离子交换反相固相萃取柱(ProElut PXA，60 mg/3 mL)购自北京迪马科技有限公司；50 mL聚丙烯塑料离心管(北京科友佳生物技术有限公司)。

称取NCG标准品5.00 mg于50 mL棕色容量瓶中，用纯水溶解并定容，配制成100 mg/L的标准储备液，于4℃下保存，有效期为1个月。

饲料样品由南昌大学医学院实验动物中心提供。

1.2 样品前处理方法

1.2.1 提取

［14，15］对饲料中目标物的提取方法，依据NCG的理化性质进行改进。准确称取2 g(精确至0.1 mg)粉碎后的饲料样品于50 mL聚丙烯塑料离心管中，加入10 mL甲醇，超声提取15 min(每隔5 min振荡混匀)，以4000 r/min离心10 min，上清液全部转移到另一离心管中。用上述方法对残渣重复提取1次，合并上清液。在合并的上清液中加入400 μL 5%(v/v)的氨水溶液后，准确移取 1 mL，用甲醇定容至50 mL，混匀。准确移取3.0 mL上述溶液，待净化。

1.2.2 净化

依次用3 mL甲醇和3 mL水活化固相萃取小柱(ProElut PXA，60 mg/3 mL)，将3.0 mL待净化上清液转移至固相萃取柱中，再依次用3 mL水和3 mL甲醇淋洗，抽至近干，用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液。经0.22 μm滤膜过滤，供上机测定。

1.3 HPLC-MS/MS 条件

HPLC条件 色谱柱:Unimicro C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:甲醇-0.1%(v/v)甲酸水溶液(5∶95，v/v)；柱温:20 ℃；流速:0.6 mL/min；进样量:10 μL。

质谱条件 电离源:电喷雾离子源(ESI)；扫描模式:正离子扫描模式(positive)；检测方式:多反应检测(MRM)；毛细管电压:4.0 kV；离子源温度:100℃；干燥气温度:300℃；干燥气流量:11 L/min；雾化气压力:1.03×105Pa。NCG的检测离子对、碎裂电压(fragmentor)、碰撞能量(collision energy)等质谱参数见表1。

1.4 加标回收试验

准确称取2 g(精确至0.1 mg)饲料样品，添加适量NCG标准溶液，涡旋混匀后静置10 min，按照1.2节所述的前处理方法进行提取和净化后，按照1.3节所述条件进行HPLC-MS/MS检测。为使标准溶液和样品溶液具有相同的基质，使用基质匹配标准曲线定量，根据添加标准品的峰面积计算回收率。

表1 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的质谱检测参数Table 1 MS parameters for the determination of N-carbamyl-L-glutamic acid

2 结果与讨论

2.1 质谱条件的优化

根据NCG的分子结构特征，在电喷雾正离子模式下对NCG标准溶液进行一级质谱分析(Q1扫描)，其一级质谱图见图2；再以m/z 191.0作为母离子，进行二级质谱分析(子离子扫描)，得到碎片离子(子离子)信息。然后对NCG二级质谱的源内碎裂电压、碰撞气能量等参数进行了优化，使NCG的母离子和特征碎片离子产生的离子对强度最大且稳定时为佳。再按照二级质谱图提供的碎片离子信息，选择最优离子对进行定性和定量。其优化后质谱参数见表1，二级质谱图见图3。

图2 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的一级质谱图Fig.2 MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.2 色谱分离条件的优化

进行HPLC-MS/MS分析时，流动相的选择对色谱分析效果和检测灵敏度都有很大的影响。分别选用甲醇水溶液和乙腈水溶液作为流动相，对比后发现以甲醇水溶液为流动相时分析物的峰形更好，所以选择甲醇水溶液。NCG呈弱酸性，试验发现在流动相中加入少量甲酸可以提高其电喷雾离子化效率，从而提高灵敏度，同时峰形更好。最终确定如1.3节所述的流动相条件，进行等度分析。

图3 N-氨基甲酰-L-谷氨酸的二级质谱图Fig.3 MS/MS spectrum of N-carbamyl-L-glutamic acid

2.3 样品前处理条件的优化

2.3.1 提取溶剂的选择

因NCG易溶于水和甲醇中，实验对比了水、甲醇水溶液(1∶1，v/v)和甲醇作为提取溶剂的效果。发现以水和甲醇水溶液作为提取溶剂时，杂质更多，干扰比较大，且回收率较低；而以甲醇作提取剂时，干扰相对较小，回收率最好。这可能是由于饲料中大多数添加药物呈水溶性，更易溶于水，而不溶于甲醇中。因此，实验最终选择甲醇为提取溶剂。

2.3.2 固相萃取柱的选择

由于饲料中添加了较多药物，成分复杂，使得样品的初提取液中杂质较多，直接测定容易对目标化合物造成干扰。为了提高灵敏度和降低检出限，对样品初提取液进一步净化处理。实验中比较了液-液萃取法和固相萃取法(SPE)两种方法，发现用三氯甲烷和正己烷分别进行液-液萃取时，去除基质效果不明显，回收率也较低，而且萃取时需消耗大量的有机溶剂，不经济且对环境造成污染，而SPE法更具有优势。所以本实验采用SPE法进行纯化富集。

分别使用反相硅胶键合吸附固相萃取柱(ProE-lut C18，200 mg/3 mL，北京迪马科技有限公司)、ProElut C18-U柱(200 mg/3 mL，北京迪马科技有限公司)和PXA柱进行净化，比较固相萃取的效果。结果发现，C18柱和C18-U柱对目标化合物的净化效果好，有一定的吸附能力，但其回收率都比较低，分别为37.6%和48.5%，难以满足要求；而PXA柱的净化效果较好，对目标化合物的吸附能力很强，回收率为95.3%。故本实验最终采用PXA柱净化。

2.3.3 洗脱条件的选择

由于PXA易吸附阴离子，而NCG为酸性化合物，在样品初提取液中加入适量的氨水溶液可使NCG呈阴离子形态，更易吸附在PXA柱上。用3 mL甲醇活化PXA柱，3 mL 0.1%(v/v)的氨水溶液平衡，上样后依次用3 mL超纯水和3 mL甲醇淋洗，抽干后用5 mL含2%(v/v)甲酸的甲醇溶液洗脱，发现回收率很低。而改用3 mL的纯水进行平衡，发现回收率很理想。分别选择了上样3、4和5 mL作比较，结果发现上样3 mL时的回收率最高，为95.3%；而上样4 mL和5 mL时回收率不理想，分别为78.9%和65.6%。可能是由于PXA柱对饲料中的某些药物的吸附能力也比较强，而其吸附容量有限，造成回收率降低，所以选择上样量为3 mL。

2.4 方法的线性范围、标准曲线及定量限

称取阴性饲料样品，按照1.2节所述方法步骤进行操作，制得样品提取液。用样品提取液对标准储备液进行稀释，得到含量分别为20、50、100、200、500、1000 μg/L的基质标准工作液，现配现用。

为了消除基质效应的影响，使用以上基质标准溶液，按照优化后的色谱和质谱条件进样测定，外标法定量。以NCG特征碎片离子的质量浓度为横坐标(X，μg/L)，峰面积为纵坐标(Y)，绘制出标准曲线。其相应的线性回归方程为 Y=8.1921 X-7.5459，相关系数(r2)为0.9999。结果表明 NCG在20～1000 μg/L范围内线性关系良好。在阴性饲料中添加80 μg/kg的NCG标准品进行测定，信噪比大于10，因此确定方法的定量限为80 μg/kg；以信噪比大于3确定检出限为24 μg/kg。

2.5 方法的回收率和精密度

准确称取饲料样品，在80、200、500 mg/kg等3个水平做添加回收试验，每个添加水平做5个平行样品。NCG在饲料中的回收率和相对标准偏差(RSD)见表2，3个添加水平的回收率在95.3%和104.0%之间，相对标准偏差在5.8%和7.5%之间，满足饲料中NCG的定量分析要求。NCG加标水平为80 μg/kg的阴性饲料的多反应监测扫描色谱图见图4。

表2 不同加标水平下N-氨基甲酰-L-谷氨酸的回收率和RSD(n=5)Table 2 Recoveries and RSDs of N-carbamyl-L-glutamic acid at different spiked levels(n=5)

2.6 方法的应用

运用本文建立的方法，对5份仔猪饲料样品和5份普通猪饲料样品中的NCG进行了检测，最终5份仔猪饲料样品中均检出NCG，平均含量为309.5 mg/kg，而普通猪饲料样品中均未检出NCG。

图4 阴性加标(80 μg/kg的N-氨基甲酰-L-谷氨酸)饲料的多反应监测色谱图Fig.4 MRM chromatogram of a negative feedstuff sample spiked with N-carbamyl-L-glutamic acid at 80 μg/kg

3 结论

本文根据饲料样品和NCG的特点，采用甲醇超声提取，混合型强阴离子交换反相固相萃取柱净化，利用高效液相色谱-电喷雾串联质谱法在MRM模式下进行定量分析，成功建立了饲料中NCG含量的检测方法。该方法操作简单，所需溶剂少，样品前处理方便迅速、可操作性高，检测速度快，其灵敏度、准确度和精密度均较高，满足饲料中NCG的分析检测要求，完全达到了预期目标，可为日后建立饲料中NCG含量测定的国家标准提供参考。

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