高效液相色谱法检测新西兰Manuka蜂蜜中的甲基乙二醛

2014-10-22费晓庆沈崇钰

色谱 2014年2期

陈磊，栾军，费晓庆，吴斌，沈崇钰，张睿

（江苏出入境检验检疫局动植物与食品检测中心，江苏南京 210001）

Manuka蜂蜜是新西兰特有的一种珍贵蜜种，是蜜蜂采集新西兰特有的一种红茶树——Manuka(Leptospermum scoparium)的花蜜酿造而成的。它区别于其他蜂蜜之处在于Manuka蜂蜜有强大而独特的抗菌活性。蜂蜜一般都具有抗菌活性，这是由蜂蜜本身的高渗透性、较强的酸度并且一般含有过氧化物造成的［1，2］。而 Manuka蜂蜜的抗菌活性则不依赖于过氧化物，因此被称为非过氧化抗菌活性(non-peroxide antibacterial activity，NPA)。1991年，Molan等［3］最早报道了这种抗菌活性的物质基础，并将其命名为Manuka独有因子(unique Manuka factor，UMF)；由于并不清楚UMF的准确分子结构，采用微生物学方法对Manuka蜂蜜的NPA进行了检测。通过比较Manuka蜂蜜和一系列不同浓度的苯酚溶液对金黄色葡萄球菌的抑制程度，从而对Manuka蜂蜜的NPA进行评级，并标示为UMF5+、UMF10+、UMF15+等等(数字表示苯酚溶液的浓度)。目前，UMF已经被新西兰UMF蜂蜜协会(U-nique Manuka Factor Honey Association，UMFHA)作为评价Manuka蜂蜜的质量指标，并要求被授权的蜂蜜生产商将其标注在产品包装上。

2008 年，Mavric等［4］发现甲基乙二醛(methylglyoxal，MGO)可能是Manuka蜂蜜具有NPA的主要物质基础。同年，Adams等［5］也报道了相同的结论，并且发现Manuka蜂蜜中MGO的含量与NPA的相关性高达0.98。由于采用微生物方法检测NPA操作比较繁琐，结果变异较大，而且物质基础不明确，因此部分研究人员呼吁采用MGO的含量来代替UMF值用于标示Manuka蜂蜜的NPA。但是，也有部分研究人员认为还没有充分的证据证明MGO能完全代表Manuka蜂蜜的NPA，而且UMF更能体现新西兰Manuka植物的地域独特性和绿色环保理念。因此，目前市场上销售的Manuka蜂蜜的产品包装上会有UMF和MGO两种指标来标示Manuka蜂蜜的抗菌活性。

目前国内对Manuka蜂蜜的研究较少，且主要集中在其抗菌活性方面。朱威等［1］和玄红专等［2］综述了国外对Manuka蜂蜜抗菌活性的研究。孙艳萍等［6］研究了 Manuka UMF25+、UMF10+ 以及其他7种蜂蜜对铜绿假单胞菌的体外抗菌活性，结论为9种蜂蜜在体外均可抑制铜绿假单胞菌，进口蜜更佳。对Manuka蜂蜜中相关物质的检测方法，仅见吕辰等［7］采用高效液相色谱-串联质谱法对多种蜂蜜中的5种双稠吡咯啶类生物碱进行了筛查，结果发现野百合碱、克氏千里光宁和倒千里光碱均未检出，而千里光菲啉和千里光宁在大多数蜂蜜中均能检出。

MGO属于二羰基化合物，国内报道的检测方法集中在大气环境监测领域。李阳等［8］建立了一种五氟化苯肼衍生化-热解吸-GC/MS方法对大气中23种羰基化合物进行了测定。牟翠翠等［9］和冯艳丽等［10］分别报道了2，4-二硝基苯肼衍生-高效液相色谱法用于测定大气中二羰基化合物。邹婷等［11］采用五氟苄基羟胺衍生与GC/MS联用的方法分析了大气中的单羰基化合物和多羰基化合物。对于蜂蜜中MGO的检测方法，目前国内尚无相关文献报道。对此，本实验室开发了高效液相色谱法对Manuka蜂蜜的MGO含量进行检测。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Agilent 1200液相色谱仪，配有自动脱气机、二元高压泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器及ChemStation数据处理软件(美国Agilent公司)；PURELAB Option-Q15纯水仪(英国ELGA公司)；电子天平(精确到0.00001 g，德国Sartorius公司；精确到0.01 g，瑞士METTLER TOLEDO公司)。

MGO对照品(40%水溶液)购自美国Sigma-Aldrich公司；邻苯二胺(o-phenylenediamine，OPD)购自阿拉丁化学试剂(上海)有限公司；甲醇(色谱纯，德国 Merck公司)；水为超纯水(18.2 MΩ·cm)；0.22 μm 有机滤膜(德国 Membrana公司)。

Manuka蜂蜜样品由新西兰UMF蜂蜜协会提供，中国蜂蜜样品由通标标准技术服务有限公司提供。

1.2 标准溶液的配制

精密量取MGO对照品100 μL，用水稀释并定容至10 mL，配成4 g/L的标准储备液(4℃避光保存)。临用前用水将标准储备液逐级稀释为适当浓度的标准工作溶液。

精密称取邻苯二胺0.6 g，用水溶解并定容至100 mL，配成6 g/L的邻苯二胺水溶液。

1.3 样品前处理

称取1 g蜂蜜溶于10 mL水中，取1 mL该蜂蜜水溶液与1 mL邻苯二胺水溶液(6 g/L)混匀，在室温、避光条件下进行衍生化反应8 h以上，过0.22 μm滤膜后进样分析。

1.4 液相色谱条件

色谱柱:Kromasil反相色谱柱(150 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相:0.1%(v/v)乙酸水溶液(A)和甲醇(B)；检测波长:318 nm；流速:1.0 mL/min；柱温:30℃；进样量:10 μL；保留时间:10.3 min。梯度洗脱程序:0～5 min，30%B；5～10 min，30%B～90%B；10～15 min，90%B；15～16 min，90%B～30%B；16～20 min，30%B。

2 结果与讨论

2.1 衍生化反应条件的优化

MGO的紫外吸收弱，需衍生化反应后再进行检测。MGO 属于 1，2-二羰基化合物，Weigel等［12］报道1，2-二羰基化合物能与邻苯二胺反应生成喹噁啉类化合物(见图1)，在反相色谱柱上有较好的保留，且紫外吸收强。Mavric等［4］和 Oelschlaegel等［13］建立的MGO检测方法中的衍生化条件均是在Weigel等［12］报道的基础上进行了修改，均为蜂蜜水溶液与邻苯二胺水溶液在室温、避光条件下反应8 h以上，只是蜂蜜样品和邻苯二胺溶液的浓度不同。本实验在室温、避光、反应时间(8 h以上)等衍生化条件不变的基础上，对衍生化试剂的浓度进行了优化。

图1 (a)邻苯二胺、(b)MGO和(c)MGO衍生化产物的化学结构式Fig.1 Chemical structures of(a)OPD，(b)MGO and(c)MGO derivative

将100 mg/L的MGO标准溶液分别与1、2、4、6、8、10 g/L的邻苯二胺水溶液按体积比1∶1混合，进行衍生化反应。通过比较MGO衍生化产物的峰面积考察衍生化效率，结果如图2所示。

从图2中可以看出，邻苯二胺水溶液的浓度从1 g/L升高到6 g/L，衍生化产物的量逐渐上升；从6 g/L升高到10 g/L，衍生化产物的量开始趋于稳定，提示反应到达完全。因此，本实验选择6 g/L的邻苯二胺水溶液。

此外，由于蜂蜜直接稀释后的水溶液含糖量高，对色谱柱伤害较大，本实验对衍生化反应中蜂蜜水溶液的浓度也进行了调整。Mavric等［4］和 Weigel等［12］报道的方法中蜂蜜水溶液的浓度分别为150和300 g/L，本实验中蜂蜜水溶液的浓度为100 g/L。并且与邻苯二胺溶液等体积混合，因此用于进样的溶液中只含有50 g/L的蜂蜜，能尽量避免高糖基质对色谱柱的损伤。在本实验的方法学验证和实际样品检测完成前后，色谱柱压力和MGO衍生化产物的保留时间均未见明显改变。

图2 邻苯二胺浓度对衍生化效率的影响Fig.2 Effect of the mass concentration of OPD on the efficiency of derivatization

2.2 检测波长的选择

文献报道的 MGO 检测波长为 312 nm［4，12］或316 nm［13］。本实验中，通过光谱扫描发现，最佳的检测波长为318 nm。

2.3 线性范围、检出限和定量限

MGO标准溶液与邻苯二胺水溶液进行衍生化反应后进行检测，以衍生化产物的峰面积Y对MGO的质量浓度X(mg/L)进行线性回归，在1～50 mg/L范围内线性良好，相关系数为0.9999。检出限(S/N=3)为 0.02 mg/L，定量限(S/N=10)为 0.06 mg/L。HPLC图谱见图3，在MGO衍生化产物的保留时间附近并没有干扰峰存在。

图3 试剂空白(水)及MGO标准溶液(1 mg/L)和Manuka蜂蜜样品的衍生产物的HPLC图谱Fig.3 HPLC chromatograms of reagent blank(water)and the derivatives of MGO standard solution(1 mg/L)and Manuka honey

Mavric 等［4］、Weigel等［12］和 Oelschlaegel等［13］报道的MGO检出限分别为0.2、0.2、5 mg/kg，本方法的检出限为0.02 mg/L，即0.4 mg/kg；差异的原因可能是所使用的蜂蜜水溶液浓度不同。Mavric等［4］和 Weigel等［12］报道的检出限较低，但蜂蜜水溶液浓度较高(150和30 g/L)，高糖分对色谱柱损伤较大；Oelschlaegel等［13］使用的蜂蜜水溶液浓度很低(15 g/L)，但检出限太高。本实验条件中蜂蜜水溶液浓度介于两者之间，在保证灵敏度的前提下，能尽量减少高糖基质对色谱柱的损伤。而且，Manuka蜂蜜样品中MGO的含量一般较高，本实验的检出限能够满足实际样品的检测需要。

2.4 精密度和回收率

在Manuka蜂蜜样品中分别添加50.0、100.0、200.0 mg/kg的 MGO，每个添加水平重复 5次，HPLC检测后计算精密度和回收率。3个添加水平下的RSD分别为1.26%、0.89%和0.69%，平均回收率分别为98.3%、101.5%和99.5%(见表1)。结果表明，蜂蜜中的其他物质对MGO衍生化产物的检测准确度并没有影响。

表1 Manuka蜂蜜中MGO的精密度和回收率(n=5)Table 1 Precision and recovery of MGO spiked in Manuka honey(n=5)

2.5 衍生化产物的稳定性

在 Manuka蜂蜜样品中分别添加50、100、200 mg/kg的MGO，每个添加水平重复3次，在衍生化反应结束后0 h和24 h分别检测，考察衍生化产物的稳定性。结果如图4所示，衍生化产物在室温放置24 h后仍稳定，蜂蜜中的其他物质对MGO衍生化产物的稳定性没有影响。

图4 MGO衍生化产物的稳定性(n=3)Fig.4 Stability of MGO derivative(n=3)

2.6 蜂蜜样品的检测

利用本方法对61个Manuka蜂蜜样品中的MGO含量进行了检测。其中，UMF标示值为5+的蜂蜜样品共14个，MGO含量为(188.0±62.1)mg/kg；UMF标示值为10+的蜂蜜样品共16个，MGO含量为(324.6±90.4)mg/kg；UMF标示值为15+的蜂蜜样品共12个，MGO含量为(523.7±59.1)mg/kg；UMF标示值为20+的蜂蜜样品共13个，MGO含量为(726.1±76.9)mg/kg；UMF标示值为 25+的蜂蜜样品共 6个，MGO含量为(1035.0±75.8)mg/kg。该检测结果与 Adams等［5］和 Stephens等［14］的报道基本相符。

此外，利用本方法对中国不同产地的油菜蜜、荆条蜜、洋槐蜜、椴树蜜、葵花蜜、枣花蜜、荞麦蜜、棉花蜜共16个样品中的MGO含量进行了检测。结果显示，MGO 含量均≤1 mg/kg。Stephens等［14］报道，新西兰Kanuka蜜、三叶草蜜、Rewarewa蜜和甘露蜜中MGO的含量均远低于 Manuka蜜。Arena等［15］报道，意大利刺槐蜜、栗子蜜、柑橘蜜、桉树蜜、甘露蜜以及多花种混合蜂蜜中MGO的含量均≤3 mg/kg。以上研究结果均显示，MGO为Manuka蜂蜜中的特有成分。本文建立的MGO含量检测方法，可以为我国进口Manuka蜂蜜的质量评价提供参考。