微波灰化-液相色谱-电感耦合等离子体质谱联用测定干食用菌中的三价铬和六价铬

倪张林，汤富彬，屈明华，莫润宏

（中国林业科学研究院亚热带林业研究所，国家林业局经济林产品质量检验检测中心(杭州)，浙江 富阳 311400）

铬(Cr)在自然界中主要以三价铬(Cr(Ⅲ))和 六价铬(Cr(Ⅵ))这两种形态存在。Cr(Ⅲ)可激活胰岛素，参与机体糖、脂肪、蛋白质的代谢，能增强胆固醇的分解和排泄，防止动脉硬化，促进氨基酸的转运和蛋白质的合成，促进人体的生长发育，但较高剂量的Cr(Ⅲ)仍表现出细胞毒性反应，长期的累积毒性还有待于进一步的研究［1］；Cr(Ⅵ)可以以和Cr2的形态通过带负电荷的细胞膜，并且促使氧化，从而导致病变发生，具有致癌和诱发基因突变的作用。

植物体对铬的富集能力较弱，我们日常食用的蔬菜水果，其总铬含量一般在0.05 mg/kg以下［2］，即使是种植在铬污染地区的植物铬含量也处在较低水平［3］。分析近几年的文献报道［4，5］，我们发现:食用菌中铬含量处在较高水平［5］，但是针对食用菌中铬形态的研究却未见报道。因此，为了对食用菌中铬的营养与安全做出正确的评价，分别测定其中的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)十分有必要。

目前国内外测定铬形态的分析方法主要有原子吸收光谱法［6-8］、分光光度 法［9，10］、离子色谱法(IC)［11］、离子色谱与电感耦合等离子体质谱联用法(IC-ICP-MS)［12］和高效液相色谱与电感耦合等离子体质谱联用法(HPLC-ICP-MS)［13-17］等。这些方法在测定水质、尿样和牛奶等液体样品中已有一些应用，尤其是HPLC-ICP-MS方法，其采用乙二胺四乙酸(EDTA)与Cr(Ⅲ)配合形成稳定的Cr(Ⅲ)-EDTA，使Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)能够在不同类型的色谱柱上实现分离，并且可保证Cr(Ⅲ)在碱性环境下的稳定性［13］；但是针对生物质固体样品，采用传统的前处理方法如浸提、搅拌和超声提取等方法进行样品前处理，提取效率低，同时在提取过程中，铬形态的稳定性得不到保证。本实验以日常食用量较大的干食用菌为例，采用微波灰化技术，通过高温消除食用菌样品中的有机物，在这个过程中同时能保证样品中原有的铬形态不发生变化，灰化后的样品用EDTA溶液配合形成Cr(Ⅲ)-EDTA稳定其中的 Cr(Ⅲ)，通过优化后的HPLC-ICP-MS方法测定其中的Cr(Ⅲ)和 Cr(Ⅵ)。

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

Flexar Binary液相泵(美国PerkinElmer公司)；NexIon 300D ICP-MS(美国 PerkinElmer公司)；PHOENIX微波灰化系统(美国CEM公司)；Milli-Q超纯水系统(美国MILLIPORE公司)。50 mL石英坩埚以及其他器皿用酸(30%硝酸)浸泡24 h后，用超纯水冲洗晾干备用。

硝酸，优级纯，德国Merck公司；氨水，优级纯，德国CNW公司；EDTA二钠盐，分析纯，广东西陇化工有限公司；Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)形态标准溶液，1000 mg/L，美国 Sigma-Aldrich公司；质谱调谐液，PerkinElmer公司。

1.2 样品前处理

干食用菌样品采用旋风磨粉碎，过40目筛，称取过筛样品0.2 g(精确至0.0001 g)于石英烧杯中，放入微波灰化炉中，设定程序为:10 min升至300℃，保持30 min，10 min升至600℃，保持2 h；运行完毕冷却后取出样品，用10 mL 1%硝酸少量多次将样品洗入50 mL离心管中，再用0.5 mmol/L EDTA二钠溶液反复洗涤至离心管中，用氨水(1∶1，v/v)调节pH值为6，定容至50 mL；将定容好的样品放置在60℃的水浴中静置60 min，使EDTA与Cr(Ⅲ)充分配合，取出冷却后上机备用，同时做样品空白和加标回收试验。

1.3 标准溶液的配制

用0.5 mmol/L EDTA二钠(pH 6)稀释Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液至1 mg/L，然后置于水浴中于60℃下保持60 min，取出冷却后作为标准储备液。标准使用液现配现用。

1.4 仪器条件

1.4.1 色谱条件

Hamilton PRP-X100阴离子交换柱(250 mm×4.6 mm，10 μm)，流动相为 60 mmol/L 硝酸(pH 9.3，氨水调节)，流速为1.0 mL/min，进样量为20 μL。

1.4.2 ICP-MS 条件

射频(RF)功率:1500 W；等离子气(Ar)流速:13 L/min；反应气(O2)流速:0.4 mL/min；Rpq(Rejection parameter q)值:0.55；雾化气流速:1.12 L/min。

2 结果与讨论

2.1 灰化条件的选择

传统的马弗炉灰化方法是在样品进入马弗炉之前需要对其进行炭化，操作繁琐并且增加样品被污染的可能性。微波灰化可省去炭化过程，并且炉温冷却迅速，节省了样品前处理时间，因此本实验采用微波灰化对食用菌样品进行前处理；另外，较大的称样量会延长灰化时间，同时也会增加样品溶液中盐分含量，对色谱柱产生不利；综合考虑，选择称样量为0.2 g进行灰化实验。

Cr属于高温元素，为了在较短的灰化时间内得到较好的灰化效果，考察了400℃至900℃下的灰化效果。结果发现，在低于600℃条件下不能将样品较好地灰化，灰分中有较多的黑色炭颗粒；当温度在600～900℃时，灰化后的样品都呈白色，灰化效果较好。为了缩短灰化炉的冷却时间，选择灰化温度为600℃。

为了验证Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)在灰化过程中是否会发生相互转化，于空白样品中分别加入10 μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)，通过灰化前处理后上机测试其加标回收率，结果表明:单独进行Cr(Ⅲ)加标回收试验时，Cr(Ⅵ)未检出；单独进行Cr(Ⅵ)加标回收试验时，Cr(Ⅲ)也未检出；Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的加标回收率均达到了85%以上，这说明在灰化过程中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)并未出现相互转化，这与文献报道的结论［8，18］相符合。

2.2 Cr(Ⅲ)-EDTA配合温度的选择

用0.5 mmol/L EDTA二钠溶液(pH 6)配制10 μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液，分别置于40、50、60、70、80 和90 ℃的水浴中 90 min，考察不同温度下标准溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的稳定性。结果表明，随着温度的升高，Cr(Ⅵ)的响应信号无明显变化，而Cr(Ⅲ)在大于80℃时响应信号下降明显(见图1)。综合考虑选择60℃作为Cr(Ⅲ)-EDTA的配合温度。

图1 配合温度对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)稳定性的影响Fig.1 Influences of stabilities of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)at different complexation temperatures

2.3 Cr(Ⅲ)-EDTA配合时间的选择

用0.5 mmol/L EDTA二钠溶液(pH 6)配制10 μg/L的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液，分别置于60℃水浴中10、20、30、60、90 和 120 min，考察不同温度下标准溶液中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的稳定性。结果表明，随着配合时间的延长，整个过程中Cr(Ⅵ)响应信号无明显变化，而Cr(Ⅲ)在大于60 min时响应信号才趋于稳定(见图2)，表明此时Cr(Ⅲ)与EDTA已完全配合，因此选择60 min作为Cr(Ⅲ)-EDTA的配合时间。

图2 配合时间对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)稳定性的影响Fig.2 Influences of stabilities of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)at different complexation times

2.4 仪器条件的选择

2.4.1 色谱柱及流动相的选择

文献［13-17］报道C18、C8硅胶柱和阴离子色谱柱均可实现Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的分离，但使用C18、C8硅胶柱分离时流动相中需要加入离子对试剂，对色谱柱损伤较大；而阴离子色谱柱应用广泛，耐受性强，因此本实验采用阴离子色谱柱分离Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)。

流动相采用60 mmol/L硝酸(pH 9.3)。加大流动相浓度可加快这两种物质的出峰时间，当流动相浓度大于60 mmol/L时导致Cr(Ⅲ)-EDTA和Cr(Ⅵ)的保留时间重叠；另外，过高的pH值也会导致保留时间重叠，过低的pH值易导致Cr(Ⅲ)-EDTA出峰时间延长。

2.4.2 质谱干扰的消除

铬元素在自然条件下有6种同位素，丰度最大的为52Cr(丰度83.8%)，但52Cr受质谱干扰严重。实验中发现:采用标准模式(STD)测试，52Cr信号完全被噪声信号湮没，为了得到理想的灵敏度，实验加入NH3作为反应气，在动态反应(DRC)模式下使NH3与干扰物反应形成其他质量数的物质，从而避免质谱干扰。通过仪器优化后，当NH3的流量为0.4 mL/min、Rpq值为0.55时，52Cr的响应值最大，同时背景干扰最低。图3为加入NH3后，检测52Cr得到的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的色谱图。

2.5 线性关系

取适量的标准储备液用流动相配制不同浓度的Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合标准溶液，在优化的条件下进行检测，确定Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的线性范围、回归方程以及相关系数(r2)；按信噪比(S/N)为3及S/N=10分别计算其检出限(LOD)和定量限(LOQ)(见表1)。结果显示:在0.5～100 μg/L范围内，目标物的峰面积(Y)与其质量浓度(X，μg/L)的线性关系良好，r2均达到0.9999以上。

图3 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液(10 μg/L)的色谱图Fig.3 Chromatogram of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)standard solution(10 μg/L)

表1 Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的线性方程、相关系数(r2)、线性范围、检出限与定量限Table 1 Regression equations，correlation coefficients(r2)，detection limits(LODs)and quantification limits(LOQs)of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)

2.6 方法的回收率与精密度

选用干香菇(mushroom)和干木耳(agaric)做加标回收试验。分别在样品中添加Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)混合标准溶液，添加水平分别为1倍LOQ(0.5 μg/L)、10 倍 LOQ(5 μg/L)和 50 倍 LOQ(25 μg/L)，按优化后的方法对样品进行前处理和测定，计算平均回收率，结果见表2。由表2可知:Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的平均回收率范围分别为78.0%～90.7%和78.3%～86.4%，RSD分别为1.5%～3.8%和1.9%～3.5%，可满足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的检测需求和安全评价。

2.7 实际样品测定

随机从市场上抽取6份干食用菌样品进行测试，其中5份样品中Cr(Ⅲ)含量在0.083～0.38 mg/kg之间，均未检出Cr(Ⅵ)；1份野生牛肝菌(bolete)样品中Cr(Ⅲ)含量为2.13 mg/kg，Cr(Ⅵ)含量为0.23 mg/kg，其色谱图见图4。

图4 牛肝菌样品及其添加5 μg/L Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)标准溶液的色谱图Fig.4 Chromatograms of a bolete sample and the bolete sample spiked with Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)solution at 5 μg/L

表2 干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的加标回收率与相对标准偏差(n=6)Table 2 Recoveries and RSDs of Cr(Ⅲ)and Cr(Ⅵ)spiked in dried edible fungi samples(n=6)

3 结论

本文建立了微波灰化-液相色谱-电感耦合等离子体质谱(LC-ICP-MS)检测干食用菌中三价铬和六价铬的方法。考察了Cr(Ⅲ)-EDTA配合温度和配合时间对Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)测定的影响，结果表明，当配合温度在60℃、配合时间为60 min时，Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的响应信号稳定。通过优化色谱条件和质谱条件，能够实现Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的较好分离，同时消除其他近质量数的质谱干扰。该方法稳定、可靠、灵敏，可满足干食用菌中Cr(Ⅲ)和Cr(Ⅵ)的测定。

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