氢化可的松在细胞共培养体系中对黑素合成的影响

叶俊华 解士海 杨观招

【摘要】目的 研究氢化可的松对人表皮共培养体系（黑素细胞与角质形成细胞）酪氨酸酶活性及黑素生成的影响。 方法 培养人表皮黑素细胞和人表皮黑素细胞与角质形成细胞共培养体系，利用四甲基偶氮唑蓝(MTT)还原法测定细胞活力，测定酪氨酸酶活性，475nm 比色法测定黑素含量。 结果 10-7mol/L、10-6μmol/L和10-5mol/L氢化可的松对于黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性及黑素生成均有较强的剂量相关性增强作用， 10-6μmol/L和10-5mol/L氢化可的松与对照组相比有显著差异（p<0.01）。结论 氢化可的松对于共培养体系酪氨酸酶活性及黑素生成有较强的剂量相关性增强作用。

【关键词】 氢化可的松 黑素细胞 角质形成细胞 共培养

【Abstract】Objective To study the effects of hydrocrtison on the tyrosinase activity and melanogenesis in co-culture model of human melanocytes and keratinocytes. Methods The model of co-culture of human melanocytes and keratinocytes was cultured and MTT was used to measure the proliferation of melanocytes and the co-cultures.The tyrosinase activity and melanin content were measured. Results The melanin synthesis and tyrosinase activity were clearly enhanced by hydrocrtison in a dose-dependent manner at concentrations of 10-7mol/L、10-6μmol/Land 10-5mol/L in both melanocytes and co-cultures. 10-6μmol/Land 10-5mol/L of hydrocrtison showed statistically significant suppression (p<0.01) than the control.Conclusion Hydrocrtison exhibits a a dose-dependent enhancing effects on melanin synthesis and tyrosinase activity in co-cultures of human melanocytes and keratinocytes.

【key words 】Hydrocrtison Melanocte Keratinocyte Co-culture

【中图分类号】R722.12 【文献标识码】B【文章编号】1004-4949(2014)07-0054-02

白癜风是指后天获得的色素完全脱失的一种皮肤病，近年来其发病有上升趋势。白癜风虽然不直接危害患者生命，但是泛发严重的白癜风会对患者心理产生严重的损害，因此针对白癜风的有效治疗就很有必要，但是目前临床尚无根治白癜风的特效疗法。其发病机制涉及遗传、免疫、黑素细胞自身死亡以及神经等多方面因素，尚无定论。临床上无论内服还是外用糖皮质激素都可以有效治疗白癜风，本研究在人表皮黑素细胞和角质形成细胞共培养体系中研究氢化可的松对于黑素合成的影响，试图揭示糖皮质激素治疗白癜风的机制。

材料和方法

1 材料：氢化可的松：购自中国药品生物制品检定所，氢化可的松溶解在0.1%乙醇中，-20oC保存，实验时用培养基调制最终浓度； M154基础培养基、角质形成细胞生长添加物购自Cascade Biologicals，胎牛血清购自杭州四季青公司，其它（氢醌、二甲基亚砜（DMSO）、10－8mol/Lα－MSH、四甲基偶氮唑蓝（MTT）、1％抗生素/抗真菌溶液、1μg/mL转移因子、中性酶、胰酶、1μg/mL 维生素E、5μg/mL 胰岛素、0.6ng/mL人碱性成纤维细胞生长因子、10－9mol/L ET-1）购自Sigma公司。

2 实验方法

2.1皮肤来源：均来源于中国青少年男性常规包皮环切术后的包皮。

2.2 黑素细胞培养：细胞培养参考以前方法进行［1］。

2.3共培养体系的建立：参见我们已报道文献［2］,简述如下：首先分别培养原代角质形成细胞和原代黑素细胞，取2到3代的细胞用于试验，将培养好角质形成细胞的和黑素细胞按照2：1混和接种，共同培养，其培养基为角质形成细胞培养基和黑素细胞培养基按2：1混合而得。

2.4 MTT实验：将共培养细胞及黑素细胞按1×104/孔接种于96孔板，氢化可的松设7个浓度（10-9mol/L、10-8mol/L、10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L、10-4mol/L、10-3mol/L），每一浓度设4个复孔，对照组直接加共培养培养基200μL，空白孔不加细胞，只加培养基，经过一定时间和条件的培养，具体可参考以前的实验，在酶标仪490nm波长（参考波长620nm）下测量各孔吸光度值，细胞增殖率＝［（待筛物各浓度平均吸光度值－空白组平均吸光度值）/（对照组平均吸光度值－空白组平均吸光度值）］×100％。

2.5酪氨酸酶活性检测 ［3］：将培养细胞按1×104/孔接种于96孔板，分别加入含不同浓度药物培养基100μL，对照组只加培养基，空白组不加细胞，阳性对照为5μmol/L8-MOP（8甲氧补骨脂素），依据对培养细胞无毒性原则选取3个浓度（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L），经过一定时间和条件的培养，具体可参考以前的实验，在酶标仪490nm波长（参考波长620nm）下测量各孔吸光度值，酪氨酸酶活性影响率＝［（待筛物组平均吸光度－空白组平均吸光度）/（对照组平均吸光度－空白组平均吸光度）］×100％。

2.6 黑素含量测定实验［4］：在60mm直径的培养皿中接种培养细胞，加入含不同浓度药物的相应培养基，对照组只加培养基，阳性对照同酪氨酸酶活性测定实验，氢化可的松根浓度选取同上（10-7mol/L、10-6mol/L、10-5mol/L），经过一定时间和条件的培养，具体可参考以前的实验，分光光度计下测量475nm（参比波长620nm）的吸光度，黑素含量＝［（待筛物组吸光度/细胞数的平均值）/（对照组吸光度/细胞数的平均值）］ ×100％，重复4次。

2.7 数据处理：采用SPSS12.0软件t检验分析，数据以 X±s 表示。

结果

1氢化可的松对细胞活力的影响：氢化可的松在（10-9mol/L－10-5mol/L）浓度范围内经MTT实验验证对所有实验培养细胞增殖都无影响。

2氢化可的松对黑素细胞及共培养细胞酪氨酸酶活性的影响：结果見表1，氢化可的松对于实验细胞酪氨酸酶活性呈剂量依赖性增强作用，与对照组比较均有统计学差异（p<0.05），10-6mol/L及10-5mol/L浓度的氢化可的松具有显著差异（p<0.01），氢化可的松对于两种实验细胞中酪氨酸酶活性的增强无统计学差别（p>0.05）。

表1氢化可的松对黑素细胞及共培养细胞中酪氨酸酶活性影响 (n=3， X±s，％)

Table one The effects of hydrocrtison on the tyrosinase activity in co-culture system (n=3， X±s，％)

浓度 (mol/L)concentrations 黑素细胞melanocyte 共培养细胞co-culture system10-7 124.67±6.43＃ 128.82±4.91＃10-6 171.28±9.59＃＃ 165.15±6.68＃＃10-5 202.58±11.29＃＃ 199.39±8.27＃＃5μmol/L 8-MOP 176.43±7.33＃＃ 169.43±8.92＃＃注：空白对照组相应值设为100%，与空白对照组相比：＃p<0.05， ＃＃p<0.01。

1氢化可的松对黑素细胞及共培养细胞黑素含量的影响：结果见表2，氢化可的松对于实验细胞中黑素合成呈剂量依赖性增强作用，与对照组比较均有统计学差异（p<0.05），10-6mol/L及10-5mol/L浓度的氢化可的松具有显著差异（p<0.01），氢化可的松对于实验中两种细胞的黑素合成增强无统计学差别（p>0.05）。

表2氢化可的松对黑素细胞及共培养细胞中黑素合成影响 (n=3， X±s，％)

Table two The effects of hydrocrtison on melanogenesis in co-culture system (n=3， X±s，％)

浓度 (mol/L)Concentrations 黑素细胞melanocyte 共培养细胞co-culture system10-7 127.53±9.12＃ 125.69±9.35＃10-6 167.24±11.57＃＃ 166.38±8.17＃＃10-5 198.26±10.28＃＃ 191.21±10.44＃＃5μmol/L 8-MOP 171.12±8.85＃＃ 178.87±12.17＃＃注：空白对照组相应值设为100%，与空白对照组相比：＃p<0.05， ＃＃p<0.01

讨 论

糖皮质激素用于治疗白癜风已经超过50年，临床疗效确定，而且强效糖皮质激素激素作用强于弱效激素。其机理尚未明确。由于自身免疫紊乱以及黑素细胞抗体产生可能是白癜风发病的重要原因，糖皮质激素可能通过调节这两方面的作用达到治疗白癜风的目的。近年来一些研究同样发现糖皮质激素还可以直接作用于黑素细胞，引起酪氨酸酶活性增加以及黑素含量增加，如刘栋［5］等研究发现氢化可的松可以增强Cloudman S91黑素瘤细胞的酪氨酸酶活性并增加其黑素合成；邓瑞春［6］等发现氢化可的松在B16黑素瘤细胞中有类似作用，类似的结果也在A375黑素瘤细胞中发现［7］。这些说明糖皮质激素还可能通过增强黑素合成发挥作用。

随着近年来黑素细胞培养技术的成熟，人们逐渐用人表皮黑素细胞以及更接近人体的人表皮角质形成细胞和黑素细胞共培养系统研究黑素合成转移的过程以及各种影响因素。本试验采用了这两种体系进一步研究了氢化可的松对于正常人表皮黑素生成的影响，发现氢化可的松可以在一定浓度范围内剂量依赖地提高酪氨酸酶的活性并增加黑素的合成。这个结果进一步说明氢化可的松除了通过免疫途径外，还可通过增强黑素合成达到治疗效果。

参考文献

［1］张弘;莫令君;黎伟珍。双花对人黑素细胞增殖及黑素合成的影响。中国热带医学，2008,8（8）：1319-20

［2］ 解士海;黄壮峰;杨观招等。氧化苦参碱对细胞共培养体系中酪氨酸酶及黑素的影响。中国热带医学，2008,8（8）：1291-92

［3］Kazuhisa S,Takahisa N,Koji S,et al. Inhibitory Effects of α-Arbutin on Melanin Synthesis in Cultured Human Melanoma Cells and a Three-Dimensional Human Model.Biol. Pharm. Bul.,2004,27(4):510-514

［4］ Mun YJ, Lee SW, Jeong HW,et al. Inhibitory effect of miconazole on melanogenesis. Biol. Pharm. Bul.,2004,27(6):806-809.

［5］ 劉栋，朱文元，谭城。皮质类固醇对培养Cloudman S91 黑素瘤细胞株黑素合成的影响。临床皮肤科杂志，2003，,32(1):3-4

［6］邓瑞春，周勇，章金刚等，氢化可的松对B16黑素瘤细胞酪氨酸酶及黑素生成影响的研究。中国药理学通报，2002,18（4）：433-6

［7］ 韩景涛，袁江，刘志军。氢化可的松对A375黑素瘤细胞黑素生成的影响。中国美容医学，2007,16（12）：1699-1700