真皮黑素细胞的研究进展

黄斐然 王大光 骆丹

真皮黑素细胞的研究进展

黄斐然 王大光 骆丹

真皮干细胞具有增殖和多向分化的潜能，角质形成细胞通过表达Wnt3a和E钙黏素来诱导真皮干细胞移行和分化为黑素细胞。研究表明，在黑素细胞形成过程中，真皮黑素细胞与表皮黑素细胞依赖的信号通路明显不同，表皮黑素细胞高度依赖干细胞因子信号通路，而真皮黑素细胞高度依赖内皮素3和肝细胞生长因子信号通路。目前关于色素痣痣细胞的来源尚不清楚，有研究认为，痣细胞来源于能分化为黑素细胞的干细胞，真皮干细胞能分化为黑素细胞，是否是痣细胞的来源尚需进一步研究。

黑素细胞；真皮；信号传导；痣，色素；表皮

黑素细胞起源于神经嵴，神经嵴细胞定向分化为成黑素细胞，成黑素细胞经真皮移行到表皮，在表皮内成黑素细胞增殖、分化为成熟的黑素细胞［1］。目前对表皮及毛囊内黑素细胞的研究已较为深入，但对真皮内黑素细胞的研究较少。概述真皮黑素细胞的来源、真皮黑素细胞信号传导机制及真皮黑素细胞与色素痣关系等的研究，有助于理解色素性疾病的发病机制。

1 人真皮干细胞（DSC）能分化为有功能黑素细胞

研究已发现，毛囊外毛根鞘隆突区存在黑素干细胞，小鼠和人毛囊外毛根鞘隆突区分离获得的干细胞，在一定条件下能向黑素细胞分化。掌跖等无毛皮肤一样富含黑素细胞，但没有毛囊，这一现象提示黑素细胞很可能也来源于真皮。

1.1 真皮干细胞可分化为黑素细胞：Li等［2-4］将从人包皮中分离出来的DSC用HESCM4培养基培养，DSC能形成特征性的3D球（真皮球），这些细胞具有增殖的能力。DSC与神经嵴干细胞相似，表达干细胞标志神经生长因子受体75（NGFRp75），而且具有多向分化的潜能，在不同细胞培养基中培养时，能分化为神经细胞，平滑肌细胞，软骨细胞和脂肪细胞。DSC与毛囊中的黑素干细胞不同，不表达黑素细胞标志HMB45和酪氨酸相关蛋白1（TYRP1），但将DSC用黑素细胞培养基培养时，分化的细胞表达黑素细胞标志小眼畸形相关转录因子（MITF）、酪氨酸 酶 相 关 蛋 白 2 （TRP2）、S100、TYRP1 以 及HMB45，说明DSC能分化为黑素细胞。

Li等采用3D皮肤重建结构进一步证明了DSC能分化为表皮黑素细胞。这种皮肤重建结构包含真皮和表皮，其中真皮是由胶原和成纤维细胞组成，表皮是由多层角质形成细胞组成。将DSC形成的真皮球种植在重建皮肤的真皮中，单个细胞可从真皮球中移行出来，并逐渐向上移行，最终定位在真皮与表皮交界处的基底膜上，然后开始表达黑素细胞特异性标记分子S100、TYRP1和HMB45，表明DSC能分化移行为表皮黑素细胞［2，5］。

作者单位：210029南京医科大学第一附属医院皮肤性病科

1.2 角质形成细胞调控真皮干细胞移行并生成黑素细胞：角质形成细胞在DSC形成黑素细胞的过程中发挥重要作用，角质形成细胞通过表达Wnt3a和E钙黏素来诱导DSC移行和分化为成熟的表皮黑素细胞。既往研究发现，Wnt能够抑制神经嵴细胞向神经元和神经胶质细胞分化，并促使神经嵴细胞向黑素细胞系分化，神经嵴细胞缺失Wnt3a或其配体β连环蛋白（catenin）后，会导致分化的细胞不表达MITF和黑素细胞分化标记，因此，Wnt3a信号是决定神经嵴细胞向黑素细胞分化的关键信号分子［6］。Wnt维持 DSC稳定并调节其分化，Zabierowski等［5］发现，DSC高表达Wnt5a信号，不表达Wnt3a信号，在DSC形成黑素细胞过程中需要经历Wnt5a向Wnt3a信号转换过程。将DSC用含有Wnt3a的黑素细胞培养基培养时，能分化为黑素细胞；把DSC放入3D皮肤重建结构中时，没有加入外源性的Wnt3a，依然能分化为表皮黑素细胞［2，5］。Jia 等［7］发现，表皮基底层表达Wnt3a，而角质形成细胞是表皮的主要构成细胞，因而推测可能是角质形成细胞产生Wnt3a诱导了DSC向黑素细胞分化。既往研究已证明，角质形成细胞通过经典的钙黏素如E钙黏素、N钙黏素、P钙黏素等决定黑素细胞在皮肤的定位，特别是E钙黏素在引导黑素前体细胞到达表皮过程中起关键作用，黑素细胞丢失E钙黏素后，将不受其临近的角质形成细胞控制，会发生定位错误，甚至恶性转变［8］。DSC既不表达E钙黏素，也不表达N钙黏素，在皮肤3D重建结构的真皮中也没有发现E钙黏素阳性的细胞，而在表皮基底层上来源于DSC的黑素细胞在增加与角质形成细胞的联系后，表达E钙黏素，因而Li等［2］认为，在黑素细胞形成过程中，需通过E钙黏素与其周边的角质形成细胞建立联系，才能形成成熟的表皮黑素细胞。

研究表明，DSC是黑素细胞的储库之一，DSC在分化为表皮黑素细胞过程中，需要角质形成细胞参与才能形成成熟的黑素细胞。

2 真皮黑素细胞与表皮黑素细胞的信号通路区别

许多信号通路和细胞因子在黑素细胞形成过程中发挥重要作用，其中干细胞因子（SCF）及其配体（Kit）、内皮素（ET）3及ET受体B和肝细胞生长因子（HGF）及其配体（c-MET）的研究比较深入。这些细胞因子在参与调控表皮黑素细胞和真皮黑素细胞发挥生理功能过程中存在一定差异。

2.1 SCF-Kit：在表皮黑素细胞，SCF通过与其配体Kit结合调节黑素细胞的存活、分化、移行和增生等SCF基因Mgf或其配体基因kit突变可导致小鼠全身毛色减退、头部和腹部白斑。Kawaguchi等［9］通过转基因的方法使鼠皮肤基底层细胞表达SCF，发现转基因鼠表皮黑素细胞较同窝正常鼠大量增加，并且出生后无明显下降，当皮下注射Kit特异性抗体ACK2后，阻断了SCF与c-Kit的结合，黑素细胞迅速减少，停止注射后，皮肤的黑素细胞还可以恢复说明SCF-Kit具有维持表皮黑素细胞存活，促进表皮黑素细胞增殖和分化的功能。对于真皮黑素细胞SCF-Kit不具有类似功能，真皮黑素细胞的生长过程中不需要SCF参与。Kunisada等［10］通过转基因的方法使鼠皮肤基底层细胞表达HGF，发现转基因鼠真皮黑素细胞明显增多，用ACK2注射HGF转基因新生鼠和非转基因新生鼠，在20 d时观察发现转基因鼠表现黑色皮肤和白色毛发，而对照组皮肤和毛发均为白色，通过组织学分析发现，转基因鼠皮肤真皮中富含黑素细胞，而对照组未发现黑素细胞，说明真皮黑素细胞形成和维持并不依赖SCF-Kit途径。

2.2 ET-3-ET受体B：ET-3主要作用是促进神经嵴细胞增殖并向黑素细胞分化，ET-3-ET受体B在真皮黑素细胞形成过程中起重要作用，ET-3能够促进真皮黑素细胞生成，维持黑素细胞在真皮中的定位。Garcia等［11］通过转基因的方法使鼠皮肤基底层细胞表达ET-3，发现转基因鼠与对照组鼠相比皮肤颜色加深，颜色加深的皮肤真皮中有黑素细胞，表皮中未发现黑素细胞，对照组鼠表皮真皮中均未发现黑素细胞。为了进一步研究ET-3对真皮黑素细胞的作用，Aoki等［12］将 ET-3 转基因鼠与 KitV620ATg斑驳病模型鼠交配，发现双转基因鼠即使是长白毛区域的皮肤颜色也变深，长白毛的皮肤毛囊中没有黑素细胞，但真皮中有黑素细胞；而对照组SCF转基因鼠与Kit V620A Tg斑驳病模型鼠交配后的双转基因鼠毛囊中没有黑素细胞，真皮中也没有黑素细胞。另外 Saldana-Caboverde 和 Kos［13］发现，ET-3或Ednrb的基因敲除小鼠黑素细胞几乎全丢失Waardenburg综合征Ⅳ型与ET-3基因或EDNR基因的突变有关，该病皮肤表现不仅有皮肤白斑，而且存在虹膜色素异常，表明ET-3能够促进真皮黑素细胞的生成，维持黑素细胞在真皮中的定位。

2.3 HGF-c-MET：HGF能促进真皮黑素细胞分化和增殖［14］。在体外，HGF可促进黑素细胞增殖，在神经嵴培养基加入HGF后，成黑素细胞数量变多、且向黑素细胞分化的数量变多，说明HGF-c-MET能够促进成黑素细胞增殖并向黑素细胞分化。在体内，HGF能促进表达其特异性受体c-MET的前体黑素细胞向真皮黑素细胞分化和增殖。与人不同，鼠出生后黑素细胞仅存在毛囊中，Kunisada等［10］通过转基因的方法使鼠皮肤基底层细胞表达HGF，在鼠胚胎17.5天时，通过免疫组织分析发现，HGF转基因鼠皮肤中TRP2阳性细胞大多分布在真皮和毛囊，虽然表皮上也有一些TRP2阳性细胞，但真皮中TRP2阳性细胞数量是表皮中的5倍，并且是正常对照组真皮中细胞2倍多，95%TRP2阳性细胞不表达c-Kit，基本都表达c-MET；而对照组同窝仔的TRP2阳性细胞大多分布在毛囊和表皮，毛囊中98%TRP2阳性细胞表达c-Kit，表皮中78%TRP2阳性细胞表达c-Kit。出生后，HGF转基因鼠皮肤是黑色的，真皮中出现大量黑素细胞，在背部皮肤真皮中的黑素细胞数量比对照组高300倍，并且皮肤颜色一直保持不变，这说明真皮黑素细胞的形成和维持依赖HGF。HGF转基因鼠真皮中黑素前体细胞不表达E钙黏素，E钙黏素是表皮黑素细胞表达的分子，对于黑素细胞进入并定位于表皮至关重要。该结果结合转HGF基因鼠真皮中存在大量黑素细胞现象，很可能说明HGF通过下调细胞E钙黏素的表达，从而使黑素前体细胞不能进入表皮而定位在真皮中，形成了真皮黑素细胞的大量聚集。尽管转HGF基因鼠表皮中的黑素细胞与对照组相比也有增多，但与真皮相比可忽略不计，并且表皮中的黑素细胞随着鼠生长逐渐消失，说明HGF不能维持表皮黑素细胞的存活。

通过以上研究结果可以得出：表皮黑素细胞高度依赖SCF-Kit信号通路，而真皮黑素细胞则高度依赖ET-3-Ednrb信号通路和HGF-c-MET信号通路。

3 真皮黑素细胞与痣的形成

目前色素痣的发病机制尚不清楚，关于痣细胞的来源也无定论［15］。有人认为，痣细胞来源于表皮黑素细胞，也有人提出，色素痣黑素细胞是由能分化为黑素细胞的干细胞而来，包括毛囊干细胞和真皮干细胞，而是由已分化的黑素细胞而来。早期研究认为，痣的形成符合Abtropfung概念，该概念为痣细胞来源于表皮黑素细胞，随着时间的推移，逐渐下降到真皮，在这一过程中相继形成了交界痣、复合痣和皮内痣［16］。然而，Worret和 Burgdorf［17］通过对来自各年龄段3534例患者的痣进行了分析，发现＜10岁患者的痣没有交界痣，多数是皮内痣，而＞60岁患者的痣12%是交界痣，这与Abtropfung概念不相符，说明痣不太可能开始于表皮黑素细胞。此外，Grichnik等［15］发现，蓝痣缺乏表皮成分，也说明痣不太可能起源于表皮黑素细胞。

Krengel［16］认为，色素痣可能来源于毛囊干细胞，已发现在鼠毛囊隆突部存在能够分化为黑素细胞的黑素干细胞。有临床证据表明，部分先天性色素痣来源于与毛囊紧密相关的细胞，例如，先天性痣切除后再生的痣围绕毛囊生长。然而，毛囊模式并不符合大多数先天性痣，尤其是在无毛的掌跖皮肤出现的先天性痣。真皮干细胞已从人无毛皮肤中分离出来了，也具有分化为黑素细胞的潜能，因而推测，痣有可能来源于DSC。Kinsler等［18］对66例先天性痣的样本进行分析，通过免疫组化发现，大多数样本痣细胞表达干细胞标记巢蛋白（nestin），而DSC也表达巢蛋白，先天性痣的基底层上有明显的正常表皮黑素细胞，推测这是因为痣是由黑素细胞移行后留下的能分化为黑素细胞的细胞发生突变增殖形成的，而不是有由已分化的表皮黑素细胞增殖形成。另外先天性痣的超微结构显示有不规则和缺口的细胞核、细胞核中有夹杂物、增多的纤毛和中心粒、痣巢被基板包绕（痣巢是由分开的单个细胞增殖形成的），这些特点均与干细胞相似。综上所述，真皮干细胞很可能是痣细胞的来源。

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Advances in dermal melanocytes

Huang Feiran,Wang Daguang,Luo Dan.Department of Dermatology and Venereology,First Affiliated Hospital of Nanjing Medical University,Nanjing 210029,China

Dermal stem cells （DSCs） have great proliferation and multidirectional differentiation potential.Keratinocytes can induce DSCs to migrate and differentiate into melanocytes by expressing Wnt-3a and E-cadherins.Researches have indicated that the generation of dermal and epidermal melanocytes is dependent on different signaling pathways.More concretely,epidermal melanocyte generation is highly dependent on the stem cell factor （SCF） signaling pathway,while dermal melanocyte generation on the endothelin 3 （ET3） and hepatocyte growth factor （HGF） signaling pathways.The origin of nevus cells in pigmented nevus is not yet clear.Some studies suggest that nevus cells may derive from the stem cells which can differentiate into melanocytes.DSCs can differentiate into melanocytes,but further research is needed to determine whether they are the source of nevus cells.

Melanocytes;Dermis;Signal transduction;Nevus,pigmented;Epidermis

Wang Daguang,Email:wangirwin@126.com

10.3760/cma.j.issn.1673-4173.2015.04.018

国家自然科学基金（81000703）；江苏省自然科学基金（BK2009437）

王大光，Email：wangirwin@126.com

本文主要缩写：DSC：真皮干细胞，NGFRp75：神经生长因子受体75，SCF：干细胞因子，ET：内皮素，Ednrb：内皮素受体 B，HGF：肝细胞生长因子，MITF：小眼畸形相关转录因子，TYRP1：酪氨酸酶相关蛋白1，TRP2：酪氨酸酶相关蛋白2

2014-07-04）