黑素细胞培养研究进展

靳旺洋，訾绍霞，刘爱英

黑素细胞培养研究进展

靳旺洋，訾绍霞，刘爱英

靳旺洋

黑素细胞培养可对皮肤科及相关科室临床及基础研究提供一个良好的科研模型，同时对美容药物开发也提供了很好的基础。黑素细胞培养方法多种多样，实际应用中需要添加各种添加剂来满足黑素细胞的生长，而不同的添加剂可对黑素细胞产生不同的影响。在实际培养时需要根据目的来选择不同的添加剂。

黑素细胞；添加剂；细胞培养；细胞因子

[J Pract Dermatol, 2016, 9(6):391-393]

黑素细胞分布广泛，存在于人体多种组织，可见于表皮、毛囊、眼、血管周围、外周神经及交感神经干、软脑膜等结构。黑素细胞来源于外胚层的神经嵴[1]，在胚胎8～10周时逐渐迁移至皮肤，在成人表皮基底层中的黑素细胞总数约为20亿，约占表皮细胞总数的2%～3%[2]。黑素细胞的主要功能是在黑素小体合成黑素颗粒，黑素颗粒进入角质形成细胞后像伞样或者帽样覆盖于细胞核顶上方，保护细胞核免受紫外线辐射损伤[3]。离体培养的黑素细胞为在体外研究各种因素对黑素细胞的增生、酪氨酸酶的活性、色素代谢的影响及黑素细胞形态的变化提供了重要的细胞模型。黑素细胞占皮肤比例较小，且分裂能力较低，因此黑素细胞体外培养比较困难。体外培养时过度增生的角质形成细胞和成纤维细胞使黑素细胞在体外环境下生长增生更加困难[4]。随着科技的发展，体外培养黑素细胞的技术和体系逐步得到优化，为研究皮肤病理生理学、皮肤细胞恶性转化、药物筛选及治疗提供了重要的手段和良好的模型，具有很强的科研价值。在黑素细胞体外培养时经常会添加各种添加剂来调节细胞的生长，如各种细胞因子、某些低浓度的致癌剂等，来充当黑素细胞的有丝分裂剂。本文对健康人表皮黑素细胞体外培养中辅助添加剂的作用作一综述，以期作为黑素细胞培养的参考。

1 细胞因子对黑素细胞的影响

1.1 碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor，bFGF）对黑素细胞的影响

bFGF 不仅是黑素细胞的促分裂剂，还是酪氨酸酶受体和蛋白激酶C（protein kinase C，PKC）的激活剂[5]，刺激黑素细胞色素的生成及树突生长。Abdel-Malek等[6]发现在黑素细胞培养液中加入bFGF可促进黑素细胞的增生，同时发现bFGF能促进黑素细胞树突的形成。有研究证明，bFGF还能增加黑素细胞酪氨酸酶的活性，且对黑素细胞的作用有最适浓度，分别为0.6 μg/L（促增生）、1.5 μg/L（促酪氨酸酶合成）[7]。bFGF对靶细胞发生效应的可能机制为：bFGF与相应受体结合后，①激活腺苷酸环化酶与鸟苷酸环化酶；②激活磷脂酶C，通过肌醇脂代谢途径产生第二信使(三磷酸肌醇和甘油二酯)，导致蛋白激酶C激活，钙离子内流；③与bFGF相关联的酪氨酸激酶活化而发挥作用；④bFGF与受体结合后产生配体受体复合物胞吞，胞吞后的bFGF大部分被进一步转位至细胞核，影响RNA聚合酶Ι，加强核糖体的转录，以加速细胞由G0期到G1期和G1期到S期的转换，刺激DNA合成增强，促使细胞的分裂与增生[4-17]。有学者尝试用bFGF作为培养基的组分进行黑素细胞的培养，发现能更有效地培养出黑素细胞，细胞从接种到贴壁的时间较短，1周就能进入指数生长期；且发现小牛血清可进一步地增强这种促进作用[8]。因此黑素细胞培养时可以适量添加bFGF，但其最适浓度目前尚无明确的数据。

1.2 α-促黑素细胞刺激素对黑素细胞的影响

α-促黑素细胞刺激素（α-melanophore stimulating hormone，α-MSH）能提高黑素细胞内环磷酸腺苷（cyclic adenosine monophosphate，cAMP）水平，进而促进黑素细胞的生长，并诱导其树突的形成[9,11]；在含α-MSH的培养条件下，体外培养的黑素细胞形成树突的数目增加，形态亦更接近于体内状态[5]。

1.3 神经生长因子对黑素细胞的影响

黑素细胞在受到损伤时表达神经生长因子（nerve growth factor，NGF）受体，提示NGF可能是这类细胞的生存因子；有学者观察到NGF不会促进黑素细胞的分裂[1,12,13]。学者分别用添加了NGF和抗NGF抗体（anti-NGF monoclonal antibody）的新鲜培养基培养黑素细胞，发现对黑素细胞树突数量和细胞间接触并无影响[14]。NGF可以使黑素细胞磷酸化[15]，从而影响黑素细胞的功能。因此培养液中是否必须添加NGF还有待进一步探索。

1.4 内皮素-1对黑素细胞的影响

内皮素-1（（endothelin-1，ET-1）可以促进黑素细胞生长、黑素合成、黑素细胞树突形成、细胞黏附[16]。因此在培养基中添加ET-1可以形成一个合适的环境，以促进黑素细胞的增生，但其最适浓度可能需要根据培养目的的不同来调整。

1.5 白细胞介素对黑素细胞的影响

白细胞介素（IL）-4对体外培养的正常人表皮黑素细胞活力有抑制作用，能使细胞增生能力降低，黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率[17]。IL-6对体外培养的正常人表皮黑素细胞活力有抑制作用，能使细胞增生能力降低，黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率[18]。IL-8 对体外培养的正常人表皮黑素细胞活力有增强作用，能使细胞增生能力和黑素合成增加，但对黑素细胞的凋亡率无显著影响[19]。浓度适当时，IL-10对体外培养的正常人表皮黑素细胞的增生起到促进作用；而IL-22和IL-23在高浓度时对体外培养的正常人表皮黑素细胞的生长和酪氨酸的活性均有抑制作用[20,21]。有研究表明，一定浓度的IL-23对体外培养的正常人表皮黑素细胞的增生起抑制作用，并有促进细胞凋亡，抑制酪氨酸酶活性的作用[22]。角质形成细胞分泌的物质可以调控黑素细胞的增生与分化，有研究表明角质形成细胞分泌的IL-33可直接或间接抑制黑素细胞的增生[23]。

1.6 肿瘤坏死因子对黑素细胞的影响

肿瘤坏死因子α对黑素细胞活力有抑制作用，能使细胞增生能力降低，黑素合成减少，增加黑素细胞的凋亡率[24,25]。有学者用IL-17 和肿瘤坏死因子作用于体外培养的正常人表皮黑素细胞，发现IL-17和肿瘤坏死因子可协同影响黑素细胞的增生和黑素合成[21]。

2 霍乱毒素与十四烷酰佛波醇己酯

2.1 霍乱毒素对黑素细胞的影响

1982年Eisinger和Marko首次报告成功大量培养出了黑素细胞，所用的培养液中就添加了霍乱毒素（cholera toxin，CT）[26]，CT可增加黑素细胞cAMP的水平[12-13,26]，促进黑素细胞DNA的合成。

2.2 十四烷酰佛波醇己酯对黑素细胞的影响

同样Eisinger和Marko的培养液中也添加了十四烷酰佛波醇己酯（phorbol myristate acetate，TPA），TPA能促进黑素细胞的附着和增生，而抑制角质形成细胞的附着和增生。有学者用不含CT和TPA的培养基（Mel-mix培养基）成功培养出了黑素细胞，并与含CT和TPA的培养液培养出的黑素细胞的相关指标做了比较，结果显示Mel-mix培养基在某些方面优于传统含有CT和TPA的方法。

CT和TPA在促进细胞增生的同时具有细胞毒性，且有致癌的风险，限制了其在黑素细胞移植方面的应用。目前很多学者在研究不添加此两种成分能否培养出满意的黑素细胞。有学者用添加了白血病抑制因子（leukaemia inhibitory facyor，LIF）和毛喉素（forskolin）的基础培养基成功培养出了大量活力良好的黑素细胞[27]，可以避免使用CT或TPA等具有毒性的物质。

3 小结

黑素细胞培养作为研究色素性皮肤病甚至皮肤相关疾病的一个手段，其培养方法随着科技的进步会更加完善。不同的培养液及添加成分会对黑素细胞造成不同的影响，因此需要根据研究目的或应用目的来选择不同的培养液及添加成分[28]。目前对于实验室研究，添加CT 和TPA的培养基是比较常见的，目前仍有应用。多数是在基础培养基（MCDB153，1640等）加入相应浓度的CT或者TPA及其他辅助的物质。目前也有公司专门生产黑素细胞培养产品：Promocell 公司的黑素细胞培养基分为含TPA和不含TPA两种。M-254-500培养基也是一个已经上市的黑素细胞培养基。对于白癜风患者的细胞移植，有学者用F12培养基添加bFGF，CT，胎牛血清等物质可以成功培养出供移植的细胞[29]。M-254-500培养基也是一个已经上市的黑素细胞培养基。也可用DMEM培养液培养表皮混悬液来进行细胞移植。黑素细胞培养过程复杂，培养液的配制是整个过程的关键，但仅仅配制好培养液是不够的，还需要做好以后每一步来确保细胞顺利生长。实验者应该在培养开始时，认真查阅文献，甚至将实验的每一步写在纸上，在实验时严格按照预定步骤操作，总结经验和教训，不断改进。

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Research progress on melanocyte cell culture

JIN Wang-yang，ZI Shao-xia，LIU Ai-ying
North China University of Science and Technology, Tangshan 063300, China

Melanocyte cell culture provides a good model for the research of dermatological department and related departments, also for the development of beauty products. Today, there is a variety of melanocyte cell culture methods can be used. In the practical application, various additives may be added to meet the growth of the cells, and different influence can be seen when different additives to be used, so additives should be selected according to the different purposes.

Melanocyte；Additive；Cell culture；Cell factor

R331

A

1674-1293(2016)06-0391-03

2016-07-18

2016-10-30）

（本文编辑 敖俊红）

10.11786/sypfbxzz.1674-1293.20160612

063300 唐山，华北理工大学研究生院（靳旺洋），煤炭总医院皮肤科（訾绍霞，刘爱英）

靳旺洋，硕士研究生，研究方向：色素性疾病的基础与临床研究，E-mail: 526584536@qq.com

刘爱英，E-mail: laydlr@163.com