HPLC —DAD法同时测定清肺抑火片中4个成分的含量

2014-10-21康绍建何雨芹张雯洁

云南中医中药杂志 2014年8期

康绍建　何雨芹　张雯洁

摘要：目的建立HPLC法同时测定清肺抑火片中栀子苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚的含量。方法采用Waters C18 色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙睛（A）-0.2%磷酸（B）为流动相梯度洗脱，流速1.0 mL·min-1，采用DAD检测器在200～400 nm波长处进行检测，柱温30 ℃。结果调取不同波长的色谱图分别计算各成分的含量，栀子苷（237 nm）、黄芩苷（277 nm）、大黄素（254 nm）和大黄酚（254 nm）进样量分别在0.2825～5.650 μg（r2=1）；0.719～14.383 μg（r2=0.9999）；0.0415～0.83 μg（r2=0.9998）；0.0440～0.8795 μg（r2=0.9999）范围内呈现良好的线性关系。平均回收率（n=6）分别为97.93%，97.89%，97.91%，98.04%；RSD分别为0.14%，0.47%，0.45%，0.21%。结论该方法快速简便，结果准确可靠，为清肺抑火片的全而质量控制提供科学的依据。

关键词：清肺抑火片；栀子苷；黄芩苷；大黄素；大黄酚；含量测定

中图分类号：R284文献标志码：A文章编号：1007-2349（2014）08-0064-03

清肺抑火片由栀子、黄芩、大黄、天花粉等9味药组成，具有清肺止嗽，降火生津的功效。用于肺热咳嗽，痰延壅盛，咽喉肿痛，口鼻生疮，牙齿疼痛，牙根出血，大便干燥，小便赤黄[1]。全国有22个批准文号，涉及21家生产企业；现行法定标准有7个，其中4个标准的检验项目只有性状和检查，3个标准增加了3～4个薄层色谱鉴别和黄芩苷含量测定；但其检测方法和评价指标不一；不能很好的控制产品质量。本文运用HPLC-DAD采用梯度洗脱，调取不同波长的色谱图同时测定清肺抑火片中栀子、黄芩和大黄的主要有效成分栀子苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚的含量[2～4]，为全面评价清肺抑火片的质量提供了简便快速、准确可靠的方法。

1仪器与试药

仪器：waters e2695/2998高效液相色谱仪（waters 2998紫外检测器，二极管阵列检测器，Empower pro色谱工作站）；分析天平（Denver TB-215D，十万分之一）；分析天平（SartorIUS BS224S，万分之一）。

试药：清肺抑火片（批号120866、130754 和121294）样品由云南腾药制药有限公司提供；栀子苷对照品（批号110749-201115）、大黄素对照品（批号110756-200110）、大黄酚对照品（批号110796-200514，含量按99.6%计算）、黄芩苷对照品（批号110715-201117，含量按91.7%计算），均由中国药品生物制品检定所提供；乙腈为色谱纯，实验用水为纯净水；其它试剂均为分析纯。

2溶液制备

2.1混合对照品溶液分别精密称取大黄素0.00813 g，大黄酚0.00883 g，置于50 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度为混合对照品溶液①；另精密称取栀子苷0.01130 g，黄芩苷0.03137 g置于20 mL量瓶中，从①中精密量取10 mL溶液加入其中，加甲醇稀释至刻度，再从中取5 mL于10 mL量瓶中加甲醇稀释至刻度即为混合对照品溶液，各对照品浓度分别为：栀子苷0.2825 mg/mL；黄芩苷0.7192 mg/mL；大黄素0.0406 mg/mL；大黄酚0.04397 mg/mL。

2.2供试品溶液取本品10片，精密称定，研细，取约1.0 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，加入甲醇100 mL，称定重量，超声40 min，放冷，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，精密量取续滤液50 mL，蒸干，残渣用甲醇转移至10 mL量瓶中定容，摇匀，滤过，取续滤液即得。

2.3阴性样品溶液根据处方分别制备缺栀子、黄芩和大黄的样品，按“2.2”项下方法制备阴性溶液，即得。

3色谱条件

4线性关系的考察

精密称大黄素0.00830 g，大黄酚0.00883 g，置于50 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度摇匀为混对对照品溶液A；另精密称取栀子苷0.01130 g，黄芩苷0.03137 g于20 mL容量瓶中，从A中精密量取溶液10 mL于其中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，为对照品溶液①；精密量取①5 mL置10 mL量瓶中，稀释至刻度，为对照品溶液②；精密量取①5 mL置25 mL量瓶中，稀释至刻度，为对照品溶液③；精密量取①5 mL置50 mL量瓶中，稀释至刻度，为对照品溶液④；精密量取④5 mL置10 mL量瓶中，稀释至刻度，为对照品溶液⑤；分别吸取上述各浓度对照品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定峰面积，以进样量（μg）为横坐标（X），以测得峰面积为纵坐标（Y），线性回归，即得4个化合物的回归方程分别为：栀子苷Y=1E+06 X+19601，r2=1；线性范围：0.2825～5.650μg。黄芩苷Y=3E+06X-1133.2，r2=0.9999；线性范围：0.719～14.383μg大黄素Y=3E+06X-4141.8，r2=0.9998；线性范围：0.0415～0.83μg大黄酚Y=5E+06X+13357，r2=0.9999；线性范围：0.0440～0.8795μg，结果表明上述各化合物线性关系良好。

5精密度、重复性和稳定性试验

精密吸取混合对照品溶液②10 μL，连续进样6次，以峰面积计算，结果栀子苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚的RSD分别为0.40、0.35、0.66、0.18%。结果表明仪器精密度良好。

取同一批号样品（批号：121294）6 份，按上述“2.2”项下供试品溶液制备方法，平行处理并测定，结果6 次测得各组分中的栀子苷平均含量为3.5228 mg/g，RSD=0.40%；黄芩苷11.9714 mg/g，RSD=0.85%；大黄素0.4308 mg/g，RSD=1.10%；大黄酚0.4860 mg/g，RSD=0.41%，说明重复性良好。

按上述“2.2”项下方法制备供试品溶液，室温条件下每2h进样1次，以峰面积计算，栀子苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚的RSD（n=7）分别为0.39、0.69、0.44、0.45%。结果表明室温条件下，供试品溶液中的4个化合物在12h内稳定。

6加样回收率试验

精密称取已知浓度的供试品（批号：121249）0.5 g，置具塞锥形瓶中，同时取6份，分别精密加入栀子苷浓度为0.1834 mg/mL、黄芩苷浓度为0.5954 mg/mL、大黄素浓0.0324 mg/mL、大黄酚0.0352 mg/mL的混合对照品溶液5 mL，加甲醇95 mL，按上述“2.2”项下方法制备所需溶液，照含量测定方法项下操作，测定供试品溶液中各成分的含量，计算栀子苷、黄芩苷、大黄素和大黄酚的平均回收率（n=6）分别为：97.93、97.89、97.91、98.04%。RSD 分别为0.14、0.47、0.45、0.21%。

7含量测定

8.1流动相的选择方面我们曾试过甲醇-0.1%磷酸、乙腈-0.1%磷酸、乙腈-0.2%磷酸3种系统作为流动相，在前两种系统下栀子苷拖尾严重，黄芩苷分离度达不到要求。而采用乙腈-0.2%磷酸系统，4个主成分峰形对称、拖尾因子均能达到要求，重现性好。

8.2样品的处理方面我们采用了3种方法，分别是超声提取、回流提取、索氏提取，4种主要成分的提取结果显示超声提取效果最佳，操作简便、快捷。

8.3实验中对市场抽到的15家企业样品按照上述实验条件进行检测，发现各生产企业间产品质量差异大，企业内各批次产品质量差异也较大，分析原因：各企业执行的标准不统一，各标准规定项目及限度不同；各企业生产工艺参数不完全相同；有的企业因标准太低，在生产时未能对各味药材的质量进行全面控制。提示生产企业应加强对原料质量严格把关，以确保产品质量，保证人民群众用药的安全与有效。

参考文献：

[1]卫生部药典委员会.卫生部药品标准中药成方制剂（第二册）[S].北京：中华人民共和国卫生部，1990：248.

[2]国家药典委员会.中华人民共和国药典：一部[S].北京：中国医药科技出版社，2010.

[3]封士兰、陈立仁、赵富虎，等.高效液相色谱法测定大黄降脂粉中大黄酸、大黄素、丹参酮ⅡA的含量[J].药物分析杂志，2000，7（20）：367-368.