双水相法和微波法提取假酸浆中总黄酮及纯化

张 慧，王 遂

(哈尔滨师范大学化学化工学院，哈尔滨150025)

假酸浆又名鞭打绣球，为茄科草本植物，是一种中草药.其全草可入药，有镇静、祛痰、清热、解毒、止咳功效，对精神病、狂犬病、感冒、风湿痛、疥癣等症有很好的治疗作用.种子亦可入药，名为假酸浆籽.具有清热退火、利尿、祛风、消炎等功效，可治疗发烧、风湿性关节炎、疮痈肿痛等症［1］.假酸浆也具有食用价值，是制作凉粉(又称冰粉)的原料.将假酸浆种子用水浸泡足够时间后，滤去种子，加适量的凝固剂，凝固一段时间后便制成了晶莹剔透、口感凉滑的凉粉，是一种消炎利尿、消暑解渴的夏季保健食品.

目前，国内关于假酸浆中总黄酮的提取方法只有浸渍法［2］.这种方法提取的总黄酮含量较低，而且存在原材料利用率低、提取过程周期比较长、溶剂消耗大、提取效率低等缺点，因此急需一些高效低耗的新方法来取代这种高耗低效的提取方式.本实验采用超声波辅助双水相萃取法和超声波微波法等两种方法提取假酸浆中的总黄酮，实现了提取方法的突破和创新.超声波辅助双水相提取法将超声波提取和丙醇－硫酸铵双水相体系提取进行集成，使超声波法良好的提取效果与醇－盐双水相水体系高效的分离作用相结合，将提取与分离两个过程合二为一，该方法提取率高、提取时间短、产物纯度高、操作简便、高效低耗［3－7］;超声波微波法是将超声和微波两种提取方法进行结合，先通过超声辅助萃取，再利用微波磁控管所产生的超高频率的震动，使假酸浆内分子间产生强烈碰撞和挤压，在分子破壁和结构松散后使黄酮迅速浸出［8－9］.超声波微波法具有操作简单、反应时间短、选择性好、提取效率高等优点.

1 实验仪器与材料

1.1 材料与试剂

材料假酸浆籽(景东银生农副产品有限公司);无水乙醇(中加化工有限公司);标准品为芦丁(上海化学试剂公司);三氯化铝;HPD－500、AB－8、D101型大孔吸附树脂(沧州宝恩化工有限公司);大孔树脂 CAD40、DM130、D1300、DA201;聚酰胺(安徽省三星树脂有限公司).

1.2 仪器与设备

752型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);SHB－II循环水真空泵(郑州长城科工贸有限公司);SHA－C水浴恒温震荡器(上海医疗器械五厂);MP－200A型电光分析天平(上海第二天平仪器厂);SWQ－IA智能数字恒温控制器(南京桑力电子设备厂);DGH－9070A型电热恒温鼓风干燥箱(上海一恒科技有限公司);超声波清洗器(KQ2200DB);格兰仕微波炉(WD900SL23－2).

2 方法与结果

2.1 超声波辅助双水相法

2.1.1 析相盐的选择

研究表明［8－10］，丙醇能与水无限互溶，当在丙醇－水体系中加入某种析相盐后可形成双水相溶液.当丙醇与水相体积之比不同时，分相所需的析相盐的量不同.常用的析相盐有硫酸铵、硫酸氢二钾、磷酸钠等.本实验选择廉价、室温溶解度高、温度效应低的硫酸铵作为配制双水相溶液的析相盐.

2.1.2 提取与分离

准确称取假酸浆1 g放于100 mL锥形瓶中，加入10 mL石油醚，超声辅助提取20 min以除去假酸浆中脂溶性成分，过滤，将滤渣在常温下挥发干燥以除去残存的石油醚.

配制双水相溶液30 mL，加入10.5 g硫酸铵.将去完脂溶性成分的假酸浆粉末加入双水相溶液中，通过改变单因素醇水比(0.4、0.5、0.6、0.7)，硫酸铵质量浓度(7.5、9.0、10.5、12 g/mL)，超声萃取时间(20、30、40、50 min)，料液比(0.027、0.033、0.040、0.047)来考察影响总黄酮提取率的因素条件.再通过正交实验确定最佳提取条件.

2.1.3 结果与分析

选择醇－水比、硫酸铵质量浓度、超声时间和料液比四种因素进行正交试验.根据表1正交试验所得的最佳条件为醇水比0.4，硫酸铵质量浓度0.25 g/mL，超声时间 30 min，料液比 0.047.在最佳条件下得到总黄酮提取率最高，提取率为3.79%.

表1 正交试验因素水平表

2.2 超声波微波法

2.2.1 提取

准确称取粉碎后的假酸浆粉末4 g，按固液比1∶25加入体积分数50%乙醇溶液，提取温度为50℃，预浸时间为10 min，在不同单因素下通过改变超声温度(40、45、50、55、60 ℃)，超声作用时间(5、10、15、20、25 min)，微波功率(小火、中火、中高火、高火)，微波作用时间(30、60、90、120、150 s)，固液比(1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40)等条件进行提取，考察影响假酸浆中总黄酮提取率的因素条件，通过正交试验确定最佳提取条件.

2.2.2 结果与分析

根据表2正交试验所得的最佳条件为微波辐射功率中火、微波辐射时间60 s、固液比1∶25、超声提取温度55℃、超声提取时间20 min，在最佳条件下总黄酮提取率最高，提取率为1.01%.

两种提取方法时间相当，但采用超声波－双水相法提取总黄酮的提取率更高.超声波－双水相协同提取法操作简单，提取与分离能同时完成，具有明显的优势.

表2 正交试验因素水平表

3 假酸浆总黄酮的纯化

3.1 上柱溶液的制备

准确称取粉碎后的假酸浆子粉1 g，至于100 mL锥形瓶中，加入10 mL石油醚，超声辅助提取20 min，去掉脂溶性成分.称取4 g去掉油脂的假酸浆子粉末，按固液比1∶25加入体积分数50%乙醇溶液，提取温度为50℃，预浸时间为10 min，控制微波辐射功率中火、微波辐射时间60 s、固液比1∶25、超声提取温度50℃、超声提取时间20 min，得到总黄酮提取液，将提取液浓缩处理，得到样品溶液.

3.2 大孔树脂的预处理

树脂用95%乙醇浸泡24 h充分溶胀后，湿法装柱.再用95%乙醇淋洗至流出液不出现白色浑浊为止，依次用蒸馏水、5%HCl溶液、蒸馏水、5%NaOH溶液浸泡冲洗，最后用蒸馏水洗至中性，备用.

准确称取经预处理的树脂各2.0 g于三角瓶中，精密加入已知质量浓度的样品溶液30 mL，置于水浴震荡器上在40℃条件下水浴震荡6 h，静置24 h充分吸附后，抽滤，得滤液和饱和吸附假酸浆总黄酮的树脂，测定滤液中总黄酮含量计算树脂饱和吸附量.取已饱和吸附的各种树脂分别置于50 mL三角瓶中，精密加入70%乙醇35 mL，静置24 h使树脂充分解析，计算滤液中总黄酮的质量浓度，并根据吸附量计算洗脱率.

表3 8种树脂静态饱和吸附量测定结果

根据表3数据分析得出，8种树脂的洗脱率相差不大，但是HPD－500的饱和吸附量相对较高，在筛选的8种树脂中，HPD－500树脂吸附和解吸能力最好，故选择HPD－500型树脂作为分离纯化假酸浆总黄酮的树脂.3.3 动态吸附试验

根据吸附率和解吸率的比较，选择比较理想的树脂，考察上柱的时间、温度、酸碱度、流速等因素对树脂吸附性能的影响以及不同浓度的乙醇对洗脱率的影响.

3.3.1 时间对吸附量的影响

由图1可知，饱和吸附量随着时间的递增而增加，在150 min时达到最大值，随着时间继续增加，饱和吸附量反而出现下降趋势，因此选择吸附时间为150 min.

图1 时间对吸附量的影响

3.3.2 温度对吸附量的影响

在图2中可以看出，温度对饱和吸附量的影响很明显，在40℃时的吸附量达到峰值，因此选择40℃较合适.

图2 温度对吸附量的影响

3.3.3 上样液pH值对吸附量的影响

由图3可知，在pH值为7时，吸附量达到最大，pH值继续增大时，饱和吸附量迅速下降，因此保持上样液pH值为7.

图3 上样液pH值对吸附量的影响

3.3.4 上样液流速对吸附量的影响

从图4可知，上样液流速为0.5～1 mL/min时，随着流速的增大，吸附量变化不大，而当流速高于1 mL/min时，吸附量急剧下降，这可能是由于流速过快，被吸附物质的分子尚未被树脂吸附就以泄露［10］.0.5 mL/min 时的吸附量虽然比 1 mL/min稍高，但由于0.5 mL/min的速率较慢，耗时长，因此选择1 mL/min的流速进行吸附.

图4 上样液流速对吸附量的影响

3.3.5 乙醇体积分数对洗脱率的影响

由图5知，总黄酮的回收率随着乙醇体积分数的增加而迅速增大，到达70%时，洗脱率达到最大，因此选用体积分数为70%的乙醇溶液进行洗脱.

4 结语

本文通过单因素和正交实验得出超声波辅助双水相法的最佳提取条件为醇水比0.4，硫酸铵质量浓度为0.25 g/mL，超声时间为30 min，料液比为0.047.在最佳条件下得到总黄酮提取率最高，提取率为3.79%.超声波微波法的最佳提取条件为微波辐射功率为中火、微波辐射时间为60 s、固液比为1∶25、超声提取温度为55℃、超声提取时间为20 min，在最佳条件下得到总黄酮提取率为1.01%.HPD500型大孔树脂吸附时间为150 min、温度为40℃、上样液 pH值为7、流速为1 mL/min、洗脱液为70%的乙醇时对假酸浆总黄酮有很好的纯化效果.

［1］《全国中草药汇编》编写组.全国中草药汇编［M］.北京:中国卫生出版社，1987.

［2］孙维蔓，王 遂.黄酮类化合物的酶法去糖基化修饰研究［J］.哈 尔 滨 商 业 大 学 学 报:自然科学版，2012，28(3):357－361.

［3］李安林，杜 慧，张换平.水－乙醇－硫酸铵体系及在分离提取天然产物中的应用［J］.安徽农业科学，2007，35(12):3563－3564.

［4］孙智敏，李发堂，殷 蓉，等.黄酮类化合物提取工艺研究进展［J］.河北化工，2005(4):7－8.

［5］林东强，朱自强，姚善泾，等.生化分离过程的新探索双水相分配与相关技术的集成化［J］.化工学报，2000，51(1):1－6.

［6］齐丽霞，郑彦峰，谈 峰.银杏叶总黄酮提取方法的比较研究［J］.江西农业学报，2007，19(1):80－83.

［7］张琳琳，王 遂.假酸浆总黄酮的提取及纯化研究［J］.哈尔滨师范大学自然科学学报，2011，27(6):66－69.

［8］王延峰，李延清，郝永红，等.超声法提取银杏叶黄酮的研究［J］.食品科学，2002，23(8):166－167.

［9］李 嵘，金美芳.微波法提取银杏叶黄酮苷的新工艺［J］.食品科学，2000，21(2):39－41.

［10］侯红瑞，陈 玲，冯毅凡，等.大孔吸附树脂分离纯化高良姜黄酮类化合物的研究［J］.食品科学，2007，28(10):258－260.