石蒜碱对人白血病细胞K562凋亡作用的研究

于 淼，于 洋，刘林涛

(1.哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心，哈尔滨150076;2.国家教育部抗肿瘤天然药物工程研究中心，哈尔滨150076;3.哈尔滨商业大学药物研究所博士后科研流动站，哈尔滨150076)

生物碱(alkaloid)广泛存在于自然界中，是一类碱性的含氮有机化合物，大多数生物碱含有复杂的氮环结构，如吡啶，吲哚，喹啉，嘌呤等，也有少数是胺类化合物.石蒜碱属于异喹啉类生物碱中的吡咯骈菲里啶生物碱.石蒜碱是中草药中具有显著药理活性的重要化学成分，研究发现石蒜碱具有抑制乙酰胆碱酯酶、催吐、镇静、阵痛、抗肿瘤等多种生物活性，因此具有很高的开发利用价值［1－3］.本文对石蒜碱诱导人慢性髓原白血病K562细胞凋亡及膜电位进行了研究，以探讨其抗肿瘤的作用机制.

1 实验材料

1.1 细胞

K562细胞株由哈尔滨商业大学生命科学与环境科学研究中心提供.

1.2 试剂及药品

石蒜碱(质量分数98%)，阿拉丁试剂有限公司;羟基喜树碱(质量分数98%)，哈尔滨圣泰药业;胎牛血清(FCS)，杭州四季青生物工程公司;溴化四氮唑蓝(MTT)，Sigma公司;碘化丙啶(PI)，Angus公司;TritonX－100，Farco公司;枸橼酸钠，北京化学试剂公司;罗丹明123(Rh123)，碧云天公司.

1.3 仪器

CO－150型CO2培养箱，日本三洋公司;680型酶标仪，美国Bio－Rad公司;CLOUTER EPICSXL流式细胞仪，美国Beckman－Coulter公司;SP2激光共聚焦扫描显微镜，德国Leica公司.

2 实验方法

2.1 试剂配制

石蒜碱:称取10 mg石蒜碱并溶于10 mL PBS中配制成1 mg/mL的母液，避光4℃保存.用无血清的1640培养液配制成所需的质量浓度.

羟基喜树碱:母液质量浓度为1 mg/mL，4℃避光保存.给药前以1640培养液稀释到所需质量浓度即可.

1640培养液:将一袋1640粉末倒入大烧杯中，加双蒸水定容至1 L，待充分搅拌溶解后加入2.5gNaOH，调整 pH 到 7.2 左右，用 0.22μm微孔滤膜过滤2次，加入已过滤的胎牛血清(水浴56℃，30 min灭活)，使血清终体积分数为10%，封口胶封口，4℃保存.

PBS 缓冲液:精密称取 0.1gKCl、4.0gNaCl、0.1gKH2PO4、1.78gNa2HPO4加入双蒸水溶解并定容至500mL，121℃，高压灭菌30min，用封口膜封口，4℃保存.

MTT溶液:避光称取MTT粉末50mg，用PBS缓冲液溶解，定容到100 mL，用微孔滤膜(0.22 μm)过滤，封口膜封口，4℃避光保存.

三联溶解液:称取SDS粉末10g，异丁醇5mL，10mol/L HCl0.1 mL用双蒸水溶解配成100 mL溶液.

2.2 细胞培养

从5%CO2，37℃的培养箱中取出K562细胞，在显微镜下进行观察.当细胞达到80%左右的高密度时，即可进行细胞传代.800 r/min离心去掉到离心管中的培养液，吸取3 mLPBS洗涤1次.取出新培养瓶加入适量的含10%胎牛血清的1640培养液，按1∶6或适当比例转移到新的培养瓶中，将培养瓶放入培养箱中继续培养［4］.

2.3 MTT法测定石蒜碱对K562细胞的细胞毒作用

取处于对数期的K562细胞，将细胞悬液调整为5×104个/mL，接种于96孔板当中，每孔加入100μL的细胞悬液，然后每孔加入100μL的石蒜碱，终质量浓度依次为:0.25、1、4、16 μg/mL，每剂量设6个平行孔;阴性组加入相同体积的培养液;阳性对照组加入100μL羟基喜树碱，终质量浓度为5μg/mL，置于37℃，含5%的二氧化碳培养箱中培养中培养72 h后，每孔加入200μL新鲜配制含0.5 mg/mL MTT，持续培养2～4 h，每孔加150 μL三联裂解液溶解，用微型振荡器进行振荡混匀10 min，用酶标仪检测确定光密度值(OD值)，参考波长490 nm，检测波长570 nm.用下面公式计算药物对肿瘤细胞的抑制率，并按中效方程计算IC50［5］.细胞抑制率% =(空白对照组 OD值－给药组平均OD值)/空白对照组平均OD值×100%

2.4 流式细胞仪检测石蒜碱诱导K562细胞的凋亡率

取处于生长对数期的人慢性髓原白血病K562细胞，收集细胞，然后细胞计数，调整浓度为1.0×105个/mL接种于6孔板中，放入7℃，5%CO2的培养箱中培养24 h待细胞贴壁后，给药，石蒜碱的终浓度分别为5、10、20μg/mL，阳性药羟基喜树碱终浓度为5μg/mL.继续放入培养箱中培养48 h后，收集细胞，1 600 r/min离心10 min，弃上清液，每个离心管中加入1 mL PBS进行洗涤并离心后，弃上清液，加入70%冰乙醇－20℃固定过夜.PBS洗1次，加入配好的 PI染液(含 PI 50 mg/mL、RNase 1 g/L、0.1%TritonX －100)，避光室温染色30 min，300目尼龙网过滤后上机检测，激发波长488 nm，发射波长 525 nm，检测细胞数为 104个［6－7］，见图 1.

2.5 激光共聚焦检测K562细胞中线粒体膜电位变化的影响

取在生长对数期的人慢性髓原白血病K562细胞调整细胞浓度为1×105个/mL接种于6孔培养板中，每孔1 mL放入37℃，5%CO2的二氧化碳培养箱内培养，待对数期后，加入不同质量浓度的石蒜碱，使其终质量浓度为 2.5、5、10 μg/mL.阳性药羟基喜树碱的终质量浓度为2μg/mL，继续培养48 h后收集细胞，加入罗丹明123染色.37℃孵育1 h.孵育结束后，1 500 r/min离心10 min，弃上层清液，收集细胞，用PBS洗涤1次.重悬细胞后，取200μL，激光共聚焦扫描显微镜观察线粒体膜电位荧光强度(FI)，激发波长为488 nm，发射波长为 540 ～570 nm［8－9］，见图 2.

图1 流式细胞仪检测石蒜碱对K562细胞的凋亡率

2.6 数据处理

用SPSS18.0软件进行统计分析.数据资料以均数±标准差(x±S)表示，多样本均数比较采用单因素方差分析.P＜0.05为具有统计学意义.

3 结果与分析

3.1 石蒜碱对K562细胞的细胞毒作用

MTT法观察石蒜碱对人慢性髓原白血病K562细胞的生长抑制作用，选取5个不同浓度的药物分别作用72 h后，计算得出石蒜碱IC50值为0.049 μmol/L，羟基喜树碱 IC50值为 0.011 μmol/L，见表1.

图2 石蒜碱作用48 h染色K562细胞线粒体膜电位变化

表1 MTT法测定72 h石蒜碱对K562细胞生长抑制作用

3.2 石蒜碱对K562细胞凋亡率的影响

人慢性髓原白血病K562细胞经过石蒜碱作用48 h后，细胞出现凋亡的亚二倍体峰，抑制了DNA的合成.经计算得出凋亡率分别为(10.94±1.52)%、(15.29±2.02)%、(19.05±2.36)%，有显著性差异(P＜0.01)，剂量越大凋亡率越高.见表2.

表2 流式细胞仪检测石蒜碱对K562细胞的凋亡率(x±S)

3.3 石蒜碱对－562细胞膜电位的影响

激光共聚焦扫描显微镜检测不同浓度的石蒜碱作用K562细胞72 h后细胞内的线粒体膜电位(Δψm).图2中，峰高表示荧光强度的高低，而荧光强度的高低间接的反映出线粒体膜电位的高低.给药组的荧光强度随给药剂量的增加而降低，且呈一定的剂量依赖关系.由表3可知，阴性对照组荧光强度为(75.67±1.15)，低、中、高三个给药组荧光强度分别为(37.56±1.46)、(29.48±1.22)和(17.61±2.16)，阳性药对照组为(19.29±0.97).与阴性对照组相比都具有统计学意义(P＜0.01)，且随着给药剂量增大，荧光强度降低越为显著.

表3 石蒜碱对K562(x±S)

4 讨论

本文采用MTT比色法检测发现石蒜碱对K562细胞具有一定的细胞毒作用，并且能够抑制K562细胞的增殖.用流式细胞仪分析经PI染色后的细胞悬液，可以发现在DNA直方图上正常二倍体细胞的G0/G1峰前会出现一个亚二倍体峰(即AP峰－apoptoticpeak)，此峰代表凋亡的细胞群体.根据此亚二倍体峰可以计算凋亡细胞占整个样品的百分率.结果显示，石蒜碱作用于K562细胞72 h后，DNA直方图上有明显凋亡峰出现，凋亡率随给药剂量的增加而升高，说明石蒜碱对K562细胞的抑制作用与细胞凋亡有关［8－9］.

膜电位下降发生在凋亡的早期阶段，即细胞凋亡的形态学改变之前.通过抑制ΔΨm的下降可以阻止凋亡的发生，说明细胞ΔΨm变化为凋亡的特异性改变.阳离子亲脂荧光素Rhodamine123能扩散到线粒体基质中，被线粒体选择性吸收，其扩散量能反映Ψm的变化.实验采用激光共聚焦扫描显微镜观察在不同浓度石蒜碱作用72 h后线粒体膜电位的变化.结果显示阴性对照组细胞荧光强度最强，即膜电位最高;阳性对照组细胞荧光强度最弱，即膜电位最低;给药组荧光强度随给药剂量升高而减弱，这说明与阴性对照组相比，膜电位依给药剂量升高而降低，且呈一定的剂量依赖关系.即是说石蒜碱能够导致K562细胞内线粒体膜电位明显下降.线粒体膜电位的降低说明线粒体膜通透性已经发生改变.在该过程中，一旦线粒体膜电位损耗，细胞就会进入无法挽回的凋亡过程.但目前石蒜碱诱导K562细胞凋亡的机制尚不明确，有待进一步研究.

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