大鼠脑组织灌注固定方法的改进

卢文朋，栗世方

0 引 言

在进行脑组织病理学实验研究中，为避免组织细胞在自身溶酶体酶的作用下溶解破坏，尽量保持其抗原性，故动物处死前需行灌注固定处理。其目的就是快速、均匀地保存标本，以保持标本类似活体状态［1］。在以往的操作基础上，对大脑灌注固定技术做了进一步改进，并对操作过程中存在的问题，提出相应措施。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 器械与试剂 止血钳2把，组织剪、眼科剪各1把，皮镊1把，输液管2副(输液器针头的针尖掐断，钝圆即可)，等渗盐水250 mL、4%多聚甲醛150 mL;小鼠抗 Neun单克隆抗体(Abcam公司，USA)、FITC标记的驴抗小鼠二抗(jackson公司，USA)。

1.1.2 实验动物 健康成年 SD大鼠20只，8周龄，雄性，280～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，合格证号:SCXK(京)2012-0001，饲养环境(22±2)℃，常规饲料喂养，自由饮水。实验过程中对动物的处置符合医学伦理学标准。

1.2 方法步骤 ①将分别装有等渗盐水和4%多聚甲醛的输液瓶悬吊于距离操作台1.5 m高的位置［2－3］。② 麻醉显效的大鼠仰卧于操作台上，固定四肢及头部，沿腹中线自剑突剪开皮肤，至下颌部，充分分离皮肤与皮下组织，暴露两侧胸廓。③游离胸前壁:止血钳夹起胸骨剑突，在膈肌上方，循外上方向，剪开双侧胸廓至胸骨上部［1］，小心分离心包膜与胸骨间的系膜，将已游离的胸廓提起、固定。此时，胸腔可充分暴露，心脏及主动脉弓清晰可见(若主动脉弓被胸腺遮掩，可适当分离)。④夹闭胸主动脉:用皮镊提起左侧肺，可见其下位于大鼠脊柱左侧的胸主动脉(胸主动脉右侧为食管)，以止血钳夹闭胸主动脉。⑤进针:左手捏持心脏，右手持眼科剪于心尖部剪开一浅口，将已剪除针尖的灌注针插入左心室并推送至升主动脉，固定使之不能退出。⑥灌注固定:打开调节阀，灌注等渗盐水，剪开右心耳，观察流出液体颜色，当流出液体清亮时，不拔出灌注针，更换输液管，4%多聚甲醛进行固定，先快后慢，颈部僵硬后，说明灌注固定完成［4］。

2 结 果

2.1 主要优点 ①可操作性强。手术操作空间大，出血量少，术野清晰;可以容易地发现胸主动脉并将其夹闭，避免了对腹部及下肢的固定;去除针尖的灌注针不易刺破心脏及血管，插至升主动脉，较单纯插入左心室进行固定，效果明显提高。②省时。从胸腔暴露至开始灌注时间约30 s，此时心脏搏动依然有力;灌注时间约5 min，此时右心耳流出清亮液体;固定开始后即可发现大鼠上肢及胡须抽动，约5 min后大鼠颈部僵硬，15 min完成固定。③省液。灌注液耗量80～100 mL;固定液耗量约80 mL。

2.2 固定后效果 大鼠只有头部及上肢固定并僵硬，腹部和下肢并未固定，鼠尾依然柔软。固定后，脑组织冰冻切片行免疫荧光检测，正置荧光显微镜下神经元细胞核特异性抗原-Neun表达清晰，见图1。

图1 FITC标记Neun荧光照片(×200)Figure 1 The immunofluorescence picture of Neun labled by FITC(×200)

3 讨 论

在有关脑组织的各种常规病理形态、免疫组化等实验研究中需要对脑组织进行固定处理，以保持蛋白类抗原。因为脑组织耐氧能力差，抗原易发生变性，所以需要对脑组织快速固定［5－6］。整块脑组织浸没于固定液，因为固定液不能以相同的速度迅速到达组织的各个部位，所以固定效果差［7－8］。通过大鼠天然的循环系统直接进行灌注固定，因固定液可快速、均匀地分布到脑组织各个部位，所以脑组织标本制备多采用此法［9－10］。关于进针方式目前主要有2种［11］:①经颈总动脉灌注固定，注射针针尖向着头部的方向注入固定液，液体的出口开在颈静脉或左心房上;②在心尖部位进针;打开胸腔，用针头插入左心室，同时右心房开一孔。第1种方法技术难度大，成功率低，故常不用;第2种方法操作相对简便，虽几经完善，但存在操作难度大、耗时耗液、固定效果不佳等多处不足。陈浩宇等［12］采用夹闭腹主动脉，代小思［13］采用夹闭胸主动脉与主动脉弓交界处等方法均存在操作繁琐且耗时较长的缺点，且未对开胸及进针方法行具体描述。Gage等［1］详细描述了开胸方法，但对全身进行灌注固定，存在耗时、耗液的不足。本方法进一步改善灌注固定方法，使其基本完善。创新性主要体现在:改变以往开胸术式、夹闭胸主动脉及处理灌注针头。针对上述3点，有关注意事项:①充分游离胸前壁，操作过程中动作轻柔，剪至胸骨角处，暴露心脏及主动脉弓;②夹闭胸主动脉，提起左侧肺脏，可清楚看到位于脊柱左侧的胸主动脉，其右侧为食管，需要注意，避免错夹;③插灌注针，未经处理的输液管针头，因过于锋利，易插破心脏和血管，在该操作中用眼科剪在心尖部剪开的深度要浅，防止剪破心脏，影响灌注固定效果，通过剪口，插入灌注针，动作要轻慢，针尖方向略偏左侧，以免刺入右心房，灌注针进入升主动脉后，可明显看到其位置，稍加固定，防止滑脱。若对心脏进行固定，可采用股动脉灌注方法［14］，Kasukurthi等［15］报道浸泡固定和经心灌注固定对周围神经的实验结果没有明显差异。总之，该方法针对脑组织等灌注固定具有可操作性强、省时、省液、提高灌注固定效果的优点，值得推广。

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