葡萄胎病理相关新基因F10重组蛋白的表达及鉴定

2014-09-28庞战军周君桂

医学研究生学报 2014年6期

庞战军，周君桂

0 引言

在我们前期的研究中，为研究滋养层有节制侵入的分子机制，选择滋养层侵袭性正常的早孕绒毛和滋养层发育异常的完全性葡萄胎组织标本，采用抑制性消减杂交的方法，建立了完全性葡萄胎与正常早孕绒毛间的差示cDNA文库，以期筛选出在葡萄胎组织中异常表达的基因，从而进一步揭示滋养层侵袭性调节的分子机制。结果筛选到3条功能未知的基因片段，并获得了其中一条新基因F10(Gen-Bank登录号AB19629)的全长序列，经原位杂交实验证实其在葡萄胎组织中呈高表达［1］。荧光定量PCR实验的结果显示:F10在葡萄胎、侵蚀性葡萄胎、绒癌组织中全部呈阳性表达，且按上述顺序F10阳性表达强度依次递增，提示F10基因可能与滋养细胞侵袭性有关［2］。另外证实，F10在子宫颈、子宫内膜等正常组织及癌旁组织不表达，在卵巢腺癌、子宫内膜癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等腺癌中阳性表达，提示新基因F10不仅与滋养细胞肿瘤密切相关，还可能参与某些腺癌的发生［3－5］。为进一步研究F10基因的功能，我们拟构建F10基因的表达载体，分离纯化F10基因编码蛋白，为F10单克隆抗体的制备及表达研究提供基础。

1 材料与方法

1.1 试剂 Es Taq DNA Polymerase，T4 DNA Ligase，快速琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒，DH5α感受态细胞，BL21(DE3)感受态细胞，Rosseta(DE3)感受态细胞，质粒小提试剂盒，Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒，SDS×PAGE凝胶制备试剂盒，Protein Show-G250蛋白快速染色液，中分子量蛋白Marker，RPMI 1640培养基，胎牛血清，DMSO，ProteinShow-G250蛋白快速染色试剂(CWbio.Co.Ltd)。表达载体pET28a，限制性内切酶BamHⅠ和HindⅢ(Fermentas)。酶标仪，BIO-RAD 680;HD-4层析工作站，上海沪西仪器厂;层析柱，Phamacia;蛋白电泳装置，BioRadⅡ;蛋白定量检测仪，Amersham Biosciences。

1.2 实验方法与步骤

1.2.1 F10基因全长序列的克隆根据F10基因全长序列设计并合成引物，上游引物F10-1添加BamHⅠ酶切位点，下游引物F10-2添加HindⅢ酶切位点(划线处)，具体序列如下:F10-1:5'CGCGGATCCATGCCTGTGCACACGCTGAGC3';F10-2:5'CCCAAGCTTCTAGCCTTCAGCTGCTGGGCTCTC 3'。用Es Taq DNA Polymerase进行PCR反应，扩增目的片段F10。反应体系如下表所示:10×Es Taq buffer 5μL，dNTP(2.5 mmol/L each)4 μL，MgCl2(25 mmol/L)3 μL，cDNA 2 μL，F10-1(10 μmol/L)1 μL，F10-2(10 μmol/L)1 μL，Es Taq DNA Polymerase 0.5 μL，水33.5μL，共50μL。扩增条件:94℃ 10min预变性;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃ 60 s共30个循环;最后72℃延伸10 min。反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查扩增结果，紫外灯下切取目的DNA片段F10，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，步骤按凝胶回收试剂盒说明书进行。

1.2.2 F10基因原核表达质粒的构建参考文献［6－7］的方法，将PCR扩增回收的F10目的片段用BamHⅠ/HindⅢ进行双酶切，37℃酶切2 h，反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。载体pET28a的线性化:pET28a用BamHⅠ/HindⅢ进行双酶切，37℃酶切2h，反应完毕后，用1%琼脂糖凝胶电泳检查酶切结果，用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段。

用BamHⅠ和HindⅢ双酶切回收的目的片段F10与线性化的pET28a进行连接，连接体系如下:pET28a 3.5 μL，F10 5.3 μL，10 × T4 DNA Ligase buffer，1 μL，T4 DNA Ligase，0.2 μL，共 10 μL。22 ℃连接4 h，将连接液10 μL转化DH5α，步骤见康为世纪DH5α感受态细胞使用说明。次日，挑取白色单菌落，进行菌落PCR，菌落PCR体系如下:2×Taq MasterMix 7.5 μL，F10-1(10 μmol/L)0.4 μL，F10-2(10 μmol/L)0.4 μL，水 6.7 μL，共 15 μL。扩增条件:94℃ 10 min预变性;94℃ 30 s、55℃ 30 s、72℃60 s共30个循环;最后72℃延伸10 min。反应结束后用1%琼脂糖凝胶电泳检测。菌落PCR鉴定正确的菌株提取质粒pET28a::F10，进行序列测定。

1.2.3 F10基因重组蛋白的诱导表达测序正确的重组表达质粒pET28a::F10转化BL21(DE3)和Rosseta感受态细胞，构建表达菌株 BL21(DE3)(pET28a::F10)和Rosseta(pET28a::F10)。构建好的表达菌株BL21(DE3)(pET28a::F10)和Rosseta(pET28a::F10)分别接种于LB培养基(含有100 μg/mL Km)中，37℃振荡培养、过夜活化。次日，按1%比例转接于新鲜 LB培养基(含有100 μg/mL Km)中，37℃、离心半径3 cm，250 r/min振荡培养，至吸光度(A600)值约为0.6时，分别加入终浓度为0、0.1、1、2 mmol/L IPTG，37 ℃、250 r/min 诱导4 h。8000×g离心1mL菌液，弃上清，加入40μL 1×PBS悬浮菌体，加入10 μL的5×SDS上样缓冲液，混匀后100℃ 煮沸10min，12000×g离心10min，取其上清液进行SDS-PAGE电泳检测。同样上述诱导的2 mL菌液离心收集，加400 μL 1×PBS悬浮菌体，用超声破碎仪超声破碎菌液，直至菌液清亮。4℃离心10 min，取40 μL 上清，沉淀用 40 μL PBS 重新悬浮，然后上清和沉淀中分别加入10 μL 5×SDS上样缓冲液，沸水煮沸10min，离心后取上清液进行SDSPAGE电泳检测。

1.2.4 F10基因重组蛋白的纯化将表达菌株BL21(DE3)(pET28a::F10)接种于2 L新鲜LB培养基(含有100 μg/mL Km)中，37℃、250 r/min 振荡培养至 A600约为0.6时，加入1 mmol/L IPTG，37℃、250 r/min诱导4 h。离心收集诱导后菌液，用150 mL 1×PBS重悬，超声破碎，分别收集上清与沉淀，用0.5%Triton 和1、2、4、8 mol/L 尿素洗涤包涵体沉淀，分别收集上清与沉淀进行SDS-PAGE电泳检测。根据电泳检测结果将目的蛋白浓度最高的尿素洗涤液，过 Ni柱进行蛋白纯化，分别用 5、20、50、100、250、500 mmol/L咪唑进行洗脱，收集洗脱液，进行SDS-PAGE电泳检测，详细步骤见Ni-Agarose His标签蛋白纯化试剂盒使用说明(康为世纪)。

2 结果

2.1 PCR扩增F10基因片段以之前我们登录GenBank的 F10基因全长 cDNA序列为模板，以F10-1/2为引物，PCR扩增目的片段F10(约900 bp)，琼脂糖凝胶电泳验证，与预期大小一致。见图1。

图1 片段F10的PCR电泳图Figure 1 Electrophoresis of PCR-amplified F10 fragment

2.2 表达质粒菌落的PCR鉴定用制备的F10基因表达载体转染DH5α菌株，制备感受态菌，筛选获得的DH5α(pET28a::F10)菌落PCR扩增的条带，约为900bp，与预期F10基因序列大小一致。见图2。

2.3 F10表达质粒序列测定原核表达质粒pET28a::F10进行序列测定，用NCBI-Blast将测序结果与GenBank中登录的F10 cDNA序列进行序列比对，测序结果显示序列完全一致，表达质粒构建成功。pET28a::F10具体测序序列如下:TAGAAATA-

图2 表达质粒的菌落PCR电泳图Figure 2 Electrophoresis of the plasmid expression by bacterial colony PCR

2.4 外源蛋白的诱导表达 37℃表达菌株BL21(DE3)(pET28a::F10)和 Rosseta(pET28a::F10)在不同浓度IPTG诱导后，表达的目的蛋白约35 000，与预期大小一致，见图3。目的蛋白主要以包涵体表达，见图4。

图3 F10诱导小试电泳图Figure 3 Small scale induced expression of F10

图4 F10诱导形式电泳图Figure 4 Electrophoresis of the induced expression of the F10 recombinant protein

2.5 F10基因重组蛋白的纯化包涵体沉淀用不同浓度尿素洗涤，电泳检测结果显示，8 mol/L的尿素洗涤液中溶出较多目的蛋白。将8 mol/L尿素洗涤液过Ni柱纯化蛋白，收集咪唑洗脱液进行SDSPAGE电泳检测，结果显示50～500 mmol/L咪唑洗脱液中，目的蛋白纯度较好，见图5。

将目的蛋白浓度较高的样品用超滤管浓缩，浓缩的蛋白浓度为1mg/mL，纯度＞90%，见图6。

图5 蛋白F10纯化电泳图Figure 5 Electrophoresis of the purified F10 recombinant protein

图6 蛋白浓缩后电泳图Figure 6 Electrophoresis of the concentrated F10 recombinant protein

3 讨论

我们发现并克隆的F10基因，序列全长980 bp，ORF 885 bp，编码蛋白由295个氨基酸组成。经生物信息学分析，结果显示:F10基因位于20号染色体，编码蛋白分子式为C1355H2217N429O408S7，相对分子质量 31 270.5，理论等电点为 10.46，脂肪簇指数72.85，总平均亲水性(GRAVY):－ 0.502，估计半衰期在体外人网织红细胞为30 h，属不稳定蛋白。Hum-mPLoc 2.0软件分析结果显示:F10编码蛋白位于细胞质或中心体。LOCtree分析提示F10编码蛋白为DNA结合蛋白。

为初步了解F10与肿瘤细胞的关系，采用反义RNA转染基因沉默技术，将人子宫内膜癌KLE细胞系中的F10基因沉默，结果发现F10基因的沉默对KLE细胞的增殖有明显的抑制作用，F10基因沉默的KLE细胞凋亡率分别较对照组增加2.4倍(24h)和3.6 倍(48 h)［8］。构建 F10 基因的真核表达载体，转染重组 pRc-CMV2-F10质粒于肺癌细胞系A549，结果发现F10有促进细胞增殖的作用，并提高A549细胞株中增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)和cyclin D1的表达水平，说明F10基因可通过上调PCNA和cyclin D1的表达促进细胞的生长增殖［9］。另外证实annexin I(钙依赖、磷脂结合蛋白)、STAT1(信号转导子与转录激活子)、脑富含膜附着信号蛋白1(brain acid soluble protein 1，BASP1)在正向F10基因转染组高表达，钙非依赖型磷脂酶A2、死亡相关转录因子1则表达降低［10］。此外，F10基因瞬间转染 A549细胞48 h，可使核转录因子激活蛋白-1和核因子-κB与DNA的结合活性分别上升23%和下降49%［11］。另外还证实，F10基因可通过下调Caspase-3和Bax表达、上调Bcl-2表达而增强肺癌A549细胞株在裸鼠体内的致瘤性［12］。以上我们的研究结果提示，F10极有可能与恶性肿瘤的细胞增殖及浸润转移密切相关，并有可能作为肿瘤基因治疗的靶基因而受到更多的关注。

在我们之前的研究中，曾将F10基因融合连接入pET-GST原核表达载体，没有移码等读码框改变，表达和纯化了Mr61000的F10/谷胱甘肽S转移酶(Glutathione S-transferase，GST)融合蛋白。并利用纯化的F10/GST融合蛋白免疫新西兰白兔，获得了F10基因产物的多克隆抗体，以此检测了F10编码蛋白在各种组织中的表达和分布［13］。但由于融合蛋白中的GST标签未切除，由此制备的多克隆抗体不宜进行有关F10基因功能的精确研究。为此，本研究中选择采用pET28a质粒构建表达载体，体外表达及纯化，获得高纯度F10基因编码蛋白，为下一步制备F10单克隆抗体及开展F10基因功能研究奠定基础。

［1］李贵堂，庞战军，周瑾，等.葡萄胎发病相关新基因的克隆［J］.广东医学，2006，27(1):22-24.

［2］周瑾，陈士岭，邢福祺，等.葡萄胎发病新基因F10与滋养细胞肿瘤侵袭相关性研究［J］.第一军医大学学报，2005，25(2):171-173.

［3］周瑾，梁卫华，李冰，等.葡萄胎发病新基因F10在不同肿瘤组织的表达［J］.广东医学，2005，26(5):596-597.

［4］周瑾，邢福祺，余良宽，等.葡萄胎发病新基因F10在原发性肝癌中的表达分析［J］.解放军医学杂志，2007，32(6):601-603.

［5］周瑾，余良宽，冯桂萍，等.葡萄胎发病新基因F10在子宫内膜癌的表达分析［J］.解放军医学杂志，2008，33(8):1042.

［6］付晓达，高美华.人环指蛋白11真核表达载体的构建及表达［J］.医学研究生学报，2012，25(1):31-34.

［7］张海锋，何红秋，刘斌，等.人免疫缺陷病毒-1 p66蛋白在大肠埃希菌中低温长时间诱导表达和活性鉴定［J］.医学研究生学报，2011，24(2):139-142.

［8］崔艳国，全松，邢福祺.RNAi下调F10基因表达对KLE细胞凋亡的影响［J］.南方医科大学学报，2008，28(3):317-319.

［9］曹晓敏，庞战军，全松，等.F10基因对细胞中PCNA和Cyclin D1表达的影响［J］.中山大学学报(医学科学版)，2009，30(1):6-9，14.

［10］曹晓敏，庞战军，全松，等.葡萄胎发病相关新基因F10功能的初步研究［J］.南方医科大学学报，2008，28(5):722-724，728.

［11］曹晓敏，庞战军，全松，等.F10基因对转录因子NF-κB、AP1活性的影响［J］.中国病理生理杂志，2008，24(5):901-904.

［12］宋亚丽，张弓，庞战军，等.F10基因过表达对A549细胞致瘤性的影响［J］.解放军医学杂志，2012，37(7):676-680.