p53在乳腺癌中的表达意义及5-氮杂脱氧胞苷对p53的调控作用

赖 静，顾 军，许 晶，吴 波，张文文，聂伟伟，宋 伟，汪泽兴，黄桂春，管晓翔

0 引 言

当前乳腺癌已经成为全球女性发病率和死亡率最高的恶性肿瘤［1－2］。其发病率在我国逐年上升且呈现年轻化趋势，在大中城市尤为明显。对乳腺癌的发生发展研究已成为目前的热点及重点。p53基因被认为是目前最重要的抑癌基因，具有抑制肿瘤细胞增长、阻滞细胞周期及促进凋亡的作用［3］。然而50%以上的肿瘤中存在p53基因突变现象，最终导致肿瘤的生长［4］。大量研究表明，野生型p53及突变型p53在乳腺癌的诊断和治疗中都发挥着重要作用［5－7］。本研究应用免疫组织化学方法检测p53在乳腺癌中的表达，研究其在乳腺癌的诊断和预后评估中的意义;并探讨了5-氮杂脱氧胞苷对p53表达调控的影响。

1 材料与方法

1.1 主要材料 组织芯片购于西安艾丽娜生物科技有限公司，包含80例乳腺癌组织、80例同一来源的癌旁正常组织。乳腺癌患者均为女性，年龄30～70岁。病理类型:浸润性导管癌72例、浸润性小叶癌2例、黏液腺癌2例、髓样癌3例、大汗腺癌1例。人乳腺癌细胞株MCF-7由本实验室保存。MCF-7细胞培养于含10%进口胎牛血清，1%双抗及0.05%胰岛素的1640培养液中，并置于37℃，含有5%CO2的细胞培养箱中培养，常规传代培养，取对数生长期细胞进行实验。

1.2 免疫组织化学及结果判定 常规组织芯片脱蜡入水，3%H2O2阻断内源性过氧化物酶10 min，充分水洗，置于pH 6.0的0.01 mmol/L构椽酸盐缓冲液中，高压加热修复抗原。滴加p53抗体后37℃孵育2小时;滴加二抗，室温孵育30 min。各步骤间以PBS冲洗5 min，连续3次。DAB显色，苏木精复染。设立阳性和阴性对照。所用试剂盒及单克隆抗体均购自福州迈新生物技术开发公司。以细胞核内出现棕黄色或棕褐色细颗粒为阳性染色，随机选择10个高倍视野对免疫组化结果进行评估。阳性细胞百分率＜10%为(－)，10%～25%为(+)，26%～50%为(2+)，＞50%为(3+)。

1.3 半定量RT-PCR 乳腺癌细胞MCF-7中加入不同浓度5-氮杂脱氧胞苷(Sigma，美国)孵育48 h后，加入 TRIzol(Invitrogen)裂解液提取 RNA，1 μg RNA逆转录为cDNA，进一步扩增，p53引物序列:上游序列为:5'-GCAATAGGTGTGCGTCAGAA-3';下游序列为:5'-ATCTCCCAAACATCCCTCAC-3'。扩增片段长度为165 bp，反应体系为25 μL。循环参数:95℃预变性2 min，以94℃变性30 s、56℃复性45 s、72℃延伸45s条件循环35次，72℃ 10min。取10μL PCR产物于1.5%琼脂糖凝胶中行电泳实验。凝胶成像仪检测并拍照。结果采用Image J软件对p53基因进行定量分析，实验重复3次，求平均值。

1.4 Western blot 乳腺癌细胞MCF-7中加入不同浓度5-氮杂脱氧胞苷孵育48 h后加入RIPA裂解液提取总蛋白质。BCA试剂盒(Thermo Scientific)定量。20 μg每泳道加样进行实验。聚丙烯酞胺凝胶电泳，分离蛋白，转膜，5%牛奶封闭pVDF膜2 h，再依次进行anti-p53抗体4℃过夜孵育、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG抗体(Abcam，美国)孵育2 h后进行曝光显影，观察相应蛋白条带表达情况。采用Image J软件对p53蛋白进行定量分析，计算蛋白显色的密度值，实验重复3次，求平均值。

1.5 统计学分析 应用SPSS 16.0软件进行统计学分析。计数资料数据以例数(百分比)形式表示。独立组间比较用χ2检验，匹配组间等级资料比较用Wilcoxon秩和检验。多组计量资料组间均数比较用单因素方差分析，多个组与同一对照组间的均数比较用Dunnet检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 p53蛋白在乳腺癌组织及癌旁正常组织中的表达 p53蛋白在80例乳腺癌组织中的阳性表达率为41.3%(33/80)，在同一来源的癌旁正常组织中其阳性表达率为22.5%(18/80)。乳腺癌组织中p53阳性表达率明显高于正常组织，差异有统计学意义(P＜0.01)，见表1。p53阳性细胞表现为细胞核染色，呈棕黄色，其中(+)19例(23.8%)、(2+)9 例(11.3%)、(3+)5 例(6%)，见图1。

表1 p53蛋白在乳腺癌及癌旁正常组织中的表达情况［n(%)］Table 1 The expression of p53 in breast cancer and normal and adjacent tissue n(%)

图1 免疫组化法测定乳腺癌及癌旁正常组织中p53蛋白的定位及表达Figure 1 The localization and expression of p53 in breast cancer and normal and adjacent tissue detected by IHC

2.2 p53蛋白与临床病理参数之间的关系 分析p53蛋白表达与乳腺癌病理分级及患者的年龄、临床分期和淋巴结转移等临床病理参数之间的关系发现，年龄越大、病理分级越高或临床分期越晚，其p53蛋白表达越高，但其表达在乳腺癌患者的年龄、病理分级、临床分期以及淋巴结转移等之间的比较，差异无统计学意义(P＞0.05)，见表2。

表2 p53蛋白表达情况与乳腺癌临床病理参数之间的关系Table 2 The relationship between p53 expression and clinicopathological factors in breast cancer

2.3 p53在乳腺癌细胞MCF-7中的表达及5-氮杂脱氧胞苷对p53的表达调控作用 联合半定量RT-PCR及Western blot实验在MCF-7中检测发现p53 mRNA及蛋白均呈低表达状态。通过MCF-7细胞与不同剂量的 5-氮杂脱氧胞苷(0、5、10、20 μmol/L)共同培养48 h后，用半定量RT-PCR法检测p53的转录表达情况发现p53mRNA表达增加，且随着5-氮杂脱氧胞苷浓度增加而呈剂量依赖趋势，差异有统计学意义(P＜0.05)，见图2。Western blot法检测p53蛋白表达情况，同样发现p53蛋白表达增加且随着药物浓度增加而呈剂量依赖趋势，差异有统计学(P＜0.05)，见图3。

图2 半定量RT-PCR检测不同浓度5-氮杂脱氧胞苷在MCF-7细胞中诱导p53 mRNA表达Figure 2 The increase expression of p53 mRNA induced by 5-aza-2'-deoxycytidine at various concentrations in MCF-7 by RT-PCR cells

图3 Western blot检测不同浓度的5-氮杂脱氧胞苷在MCF-7细胞中诱导p53蛋白表达Figure 3 The increase expression of p53 protein induced with 5-aza-2'-deoxycytidine at various concentrations in MCF-7 by Western blot

3 讨 论

乳腺癌是严重威胁女性健康的恶性肿瘤之一，其发病机制尚未被阐述清楚。作为一个核序列特异性的转录因子，p53位于人染色体17p13.1，其编码的p53蛋白是相对分子质量为53000的核磷酸蛋白质［8］，突变后可导致p53所编码蛋白的功能丧失，失去诱导细胞周期阻滞和细胞凋亡发生的功能［9］。以此同时，突变p53可转录下游靶基因，产生类似癌基因特性的功能，从而加速癌症进展、阻止癌细胞凋亡的发生等［10］。针对乳腺癌的病理特征研究中发现，p53蛋白表达为阳性的乳腺癌具有较强的增殖能力，易发生复发和转移，预后相对较差［11－13］。说明乳腺癌的发生、进展及不良预后与p53经常发生突变有关［14］。本研究结果显示80例乳腺癌组织中的p53蛋白阳性率明显高于对应的癌旁正常组织，差异有统计学意义，提示p53蛋白表达可能参与了乳腺癌的发生和发展。尽管p53蛋白表达与乳腺癌临床病理参数之间的差异无统计学意义，但结果显示p53蛋白表达可随着年龄、肿瘤恶性度及临床分期的增高相应地增高。这也能在一定程度上提示p53蛋白表达异常可能导致细胞周期调控失常和细胞异常增殖促进乳腺癌的恶性演变进程。

本实验同样检测了乳腺癌细胞株MCF-7中p53的表达情况。半定量RT-PCR提示p53mRNA在MCF-7中低表达，同时Western blot法检测p53蛋白发现其蛋白表达水平亦低。这一结果与乳腺癌组织中p53蛋白表达结果不一致。既往研究表明在乳腺癌细胞株MCF-7中p53表达为野生型［15］，这表明在MCF-7中p53可能表达抑癌基因作用，即在MCF-7中p53发挥抗肿瘤效应。另有研究表明，p53基因抗肿瘤活性丢失除了与突变、缺失等有关外，还与其启动子区CpG岛高甲基化有关，这是p53抑癌基因失活的又一重要机制［16－17］。5-氮杂脱氧胞苷作为DNA甲基转移酶抑制剂，已经被FDA批准用于血液疾病的治疗中，其可逆转启动子区的甲基化使抑癌基因表达增加，最终发挥抗肿瘤作用［18］。本研究结果显示，无论在mRNA或是在蛋白水平上，均已证实在不同浓度5-氮杂脱氧胞苷诱导作用下MCF-7细胞恢复p53表达且呈剂量依赖趋势。因此，可以推测在野生型乳腺癌细胞MCF-7中p53启动子区可能受到甲基化调节，利用5-氮杂脱氧胞苷可使其发生去甲基化，上调p53基因的表达，最终增强p53抑癌基因的功能。综上所述，本研究结果表明p53可能在乳腺癌的发生发展中起重要的作用。而针对5-氮杂脱氧胞苷的进一步研究有望为治疗p53低表达乳腺癌药物的研发提供依据。

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