磁珠法试剂与Trizol试剂检测肠道病毒核酸的效果观察

王述莲，邓中平，呼建民，钟礼立，黄 河

肠道病毒属于RNA病毒，是引起手足口病的主要病原体。该病毒感染性强、致病率高［1－3］。快速检测肠道病毒是治疗手足口病的重要基础。目前，国内外常规检测肠道病毒的核酸提取方法是Trizol法，该方法需多次离心、洗涤、吸弃废液等开放操作，过程中易造成污染和核酸丢失，也易导致检测结果重复性和稳定性不理想;而磁珠法是近年来研发的一种较为先进的肠道病毒核酸提取方法，该方法为常温裂解释放核酸，无需使用水浴或干浴设备，不必反复高速离心，操作方便，且节约成本。本文将肠道病毒核酸的磁珠法提取试剂与常规Trizol法提取试剂进行对比观察，即以“新型的”磁珠法肠道病毒核酸提取试剂为观察试剂，以“常规的”Trizol法提取试剂为对照试剂，旨在探讨磁珠法试剂的临床检测效果。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集临床诊断为手足口病患者的咽拭子标本412例，其中男240例，女172例;年龄1～12岁，平均4.5岁。所有病例确诊均严格按照国家卫生部颁布的《手足口病诊疗指南》(2010年版)执行［4］。以“新型的”磁珠法肠道病毒核酸提取试剂为观察试剂，以“常规的”Trizol法提取试剂为对照试剂。

1.2 主要试剂和仪器 “新型”肠道病毒核酸检测试剂购自湖南圣湘生物科技有限公司，采用磁珠法提取肠道病毒核酸，最低检测限为400 copies/mL;对照试剂购自美国Invitrogen公司，采用Trizol法提取肠道病毒核酸，采用已上市的检测试剂盒进行检测。按照试剂盒说明书，提取试剂和反应试剂均在检测过程中配套使用。磁珠法和Trizol法提取的肠道病毒核酸，均采用美国Stratagene公司的Mx3000P实时荧光定量PCR仪进行检测。

1.3 方法

1.3.1 磁珠法操作步骤 ①在1.5 mL灭菌离心管中依次加入600μL RNA提取“溶液1”、200μL待测样本、100 μL RNA提取“溶液2”，震荡混匀10 s后，室温静置10 min;②瞬时离心后，将离心管置于分离器上，3 min后吸弃废液;③向离心管中加入600 μL RNA提取“溶液3”，加入200 μL RNA提取“溶液4”，震荡混匀5 s，瞬时离心后将离心管再次置于分离器上，3 min后，将废液全部吸弃;④向离心管中加入30 μL RNA洗脱液，将离心管壁上磁珠洗脱到管底，室温静置10 min后，将离心管再次置于分离器上，静置3 min，然后将RNA洗脱液移入新的1.5 mL灭菌离心管中。

1.3.2 Trizol法操作步骤 ①在1.5 mL的灭菌离心管中依次加入样本 500 μL、Trizol试剂 500 μL，充分混匀，室温放置10 min;②加入200 μL氯仿，拧紧盖，用力震荡，直至溶液充分乳化、成乳白状、无分相现象，室温静置10 min;③于4℃、13 000 r/min离心15 min，吸取上层液相移入另一离心管;④加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管，充分混匀液体，室温放置10 min;⑤于4℃、13 000 r/min离心15 min，弃上清;⑥向离心管内加入75%乙醇1 mL，震荡混匀，于4℃、13000 r/min离心10 min，弃上清，在超净台中干燥5 min;⑦向离心管内加入试剂盒中的DEPC水 50 μL，充分混匀。

1.3.3 临床样本检测 分别采用磁珠法试剂和Trizol法试剂，对412例咽拭子标本进行临床样本核酸提取。①磁珠法提取样本，是经样本裂解、核酸吸附、杂质洗脱后获得核酸。②Trizol法提取样本，是经样本裂解，氯仿去杂质，离心获得液相后，采用异丙醇析出核酸，乙醇漂洗，室温干燥，加水复溶后获得核酸。本组412例标本均按照上述2种方法的操作步骤，分别提取核酸。尔后，再分别采用各自的检测试剂，采用美国Stratagene公司的Mx3000P实时荧光定量PCR仪进行核酸检测。

1.4 统计学分析 采用SPSS 15.0软件进行统计分析，应用Kappa评价方法对磁珠法试剂和Trizol法试剂及复核检测结果进行诊断的一致性分析，检验水准为 α=0.05。Kappa值参考评价原则:0.75 ＜ κ≤1，诊断一致性好;0.4 ＜ κ≤0.75，诊断一致性一般;0≤κ≤0.4时，诊断一致性差。以 P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

本研究共检测咽栻子临床样本412例，分别采用磁珠法和Trizol法的肠道病毒检测试剂盒说明书，提取样本的肠道病毒核酸后，再采用各自的检测试剂进行检测。2种方法检测得到的阳性和阴例数，经统计学处理，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 磁珠法试剂与Trizol法试剂检测结果比较［n(%)］

Kappa检验的输出结果为:κ =0.983，P ＜0.05。磁珠法试剂和Trizol法试剂及复核检测结果的一致性有统计学意义，提示诊断一致性好。

3 讨 论

手足口病患者肠道病毒的核酸检测步骤，一般是先要提取肠道病毒核酸，尔后再采用荧光定量PCR方法进行核酸检测。由于荧光定量PCR方法具有高敏感性、高精确性等特点，所以，该方法可用于肠道病毒感染的早期诊断和无症状病毒携带者的检测［5－7］。但肠道病毒核酸提取方法不同，可导致病毒核酸提取效果的差异，进而会影响该病毒检测结果的准确性。本研究采用磁珠法和Trizol法检测同一批412例样本，虽然磁珠法试剂盒检测结果的阳性率(33.7%)高于 Trizol试剂盒阳性率(33.0%)，但差异无统计学意义。提示，磁珠法试剂盒与市面常见试剂盒的检测结果一致性较高。

在样本核酸的提取过程中，Trizol法需反复高速离心，提取步骤比较繁琐;需使用氯仿、异丙醇等有毒副作用的试剂;需转移液相到新的离心管，该步骤是提取成败的关键，受到操作人员手法和经验等因素的影响，易吸取到中间层和下层的杂质，影响到提取效率;在转移样本的过程中还易出现样本间的交叉污染，影响到检测结果的准确性。而磁珠法通过核酸的释放、磁珠吸附核酸、一步洗涤杂质，去除了杂质的干扰，可获得高质量的核酸;同时，磁珠法无需加热、转移上清等操作，较易将核酸完整地提取出来，操作简便;提取过程在一个封闭的离心管内完成，无需转移液体，可有效防止样本间的交叉污染，使该方法的准确性、灵敏度大大提高，降低了对操作人员的技术要求，节省了检验时间，可更好地指导医师进行临床诊断和治疗，在临床上具有较高的应用价值。

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