沙苑子总黄酮对内质网应激诱导的细胞凋亡在百草枯致大鼠肺损伤中的保护作用

张志坚，吴 灿，田 黎，首云峰，彭礼波

0 引 言

作为农业生产中常用的除草剂，百草枯自问世以来中毒事件屡有发生。肺是百草枯作用于机体最主要的靶器官，肺损伤是百草枯中毒后最常见的致死原因。目前认为百草枯中毒后氧化应激是肺损伤的主要机制之一，而内质网对氧化应激非常敏感，当其稳态被打乱后将导致内质网应激(endoplasmic reticulum stress，ERS)。研究发现在ERS反应中，ERS相关蛋白双链RNA依赖性蛋白激酶样内质网激酶(PRK-like ER associated kinase，PERK)、肌醇需要酪1α(inositol requiring protein 1-alpha，IRE1α)、活化的转录因子 4(activating transcription factor 4，ATF4)、X-盒结合蛋白-1(X-box binding protein 1，XBP1)和活化的转录因子6(activating transcriptiong factor 6，ATF6)表达均会上调，其中ATF4和XBP1具有细胞保护效应。当ERS持续存在时，ATF4和XBP1将诱导CCAAT增强子结合蛋白CHOP，促进细胞凋亡的发生［1－2］。

沙苑子黄酮(total flavonoids from astragalus complanatus，FAC)是从中药沙苑子成熟种子中提取的有效成分，具有补益肝肾的功效，其有效成分主要为黄酮类、三萜类及有机酸，目前已发现该药具有抗纤维化、抗衰老、抗肿瘤等作用［3－4］。本研究旨在探讨ERS诱导的细胞凋亡在大鼠百草枯中毒后肺损伤中的作用及FAC对其影响。

1 材料与方法

1.1 百草枯诱导急性肺损伤模型的建立及动物分组30只清洁级Spragne-Dawley(SD)大鼠由重庆医科大学实验动物中心提供，生产许可证号:SCXK(渝)2011－0002，体重(220±40)g，雌雄各半，饲养温度18～26℃，光照时间为12 h/d，饲养清洁级大鼠颗粒饲养，自由取食。将实验动物按随机数字表法分为对照组，肺损伤模型(ALI)组和沙苑子总黄酮干预(ALI+FAC)组。ALT组、ALI+FAC组参照采用本课题组已成功建立的百草枯灌胃法(80 mg/kg)复制大鼠百草枯肺损伤模型［5］。对照组给予等量等渗盐水灌胃。从造模后30 min开始，ALI+FAC组即给予FAC［70mg/(kg·d)］灌胃治疗，而ALI组和对照组给予等量等渗盐水灌胃。于造模后第4天处死所有大鼠。

1.2 生化指标的测定 所有大鼠于实验开始后第4天3%的戊巴比妥(35 mg/kg)腹腔注射后腹主动脉放血处死。处死后取大鼠肺组织放置于－80℃冰箱保存。取右肺组织300 mg制备组织匀浆，采用试剂盒(南京建成生物制品有限公司)测定SOD、CAT和MDA含量。Lowry法测定蛋白含量。

1.3 肺组织细胞凋亡的测定 采用罗氏公司的TUNEL法凋亡检测试剂盒对原位细胞凋亡进行检测，严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 实时定量PCR法分析内质网应激相关基因表达 严格按照RNA提取试剂盒进行RNA提取。取RNA样品2 μg，按RNA逆转录试剂盒说明书配制反应混合液，PCR仪上 37℃反应 60 min，产物－20℃保存备用。实时定量 PCR，取0.5 μL cDNA作为模板。XBP-1基因(产物103 bp)扩增引物对:上游引物5'-CTGCCGCTCATGGTTCCGGG-3'，下游引物5'-TCTCCTCCGGGCTCAGGTGC-3';ATF4基因(产物204 bp)扩增引物对:上游引物5'-CCAGGGCCCCACCAGACAGT-3'，下 游 引 物 5'-CGCCAGTGAGGGCTTCCTGC-3';CHOP基因(产物373 bp)扩增引物对:上游引物5'-GAGTCTCTGCCTTTCGCCTT-3'，下游引物5'-TCTCATTCACCTGCTCCTTCTC-3';β-actin基因(产物173bp)扩增引物对:上游引物5'-GACATCCGTAAAGACCTCTATGCC-3'，下游引物5'-ATAGAGCCACCAATCCACACACAGAG-3'。PCR产物以2%琼脂糖电泳检测，用凝胶图像分析仪扫描图像，进行吸光度分析。

1.5 Western blot检测各组肺组织CHOP蛋白的表达 取各组大鼠肺组织各200 mg加入0.5 mL组织蛋白裂解液，匀浆器研麿制成匀浆，离心半径10 cm，15000 r/min离心20 min。取上清液，按Bradford法测定蛋白浓度。取100μg样本，电泳结束后湿转移法将蛋白条带转移到PVDF膜上，50 g/L脱脂奶粉封闭，分别加入CHOP 1抗(Santa Cruz)(1∶500)置4℃冰箱振荡孵育过夜。TBST洗膜后，加入HRP标记的2抗(1∶20000)室温反应1h。TBST洗涤，ECL化学发光试剂于暗室中显影，X线胶片曝光后拍照。

1.6 HE染色后肺组织形态学观察 每组大鼠任取4只，处死动物时取左上肺组织迅速浸入10%甲醛溶液中固定，经二甲苯处理、梯度乙醇脱水、石蜡包埋、切片、HE染色，光镜观察。

1.7 统计学分析 所有数据采用SPSS 16.0统计软件分析，计量资料以均数±标准差()表示，采用方差分析及q检验比较组间差异，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 FAC对肺组织SOD、MDA和CAT的影响大鼠百草枯灌胃4 d后，肺组织MDA水平明显升高(P＜0.01);FAC治疗后MDA水平明显降低。ALI组与对照组比较，SOD和CAT活性明显降低(P＜0.01)，FAC治疗后肺组织SOD和CAT活性则明显升高。见表1。

2.2 FAC对肺组织 CHOP蛋白表达的影响Western blot结果显示，与对照组比较，ALI组肺组织CHOP蛋白表达上调;经 FAC处理后肺组织CHOP蛋白表达明显下降。见表1，图1。

2.3 FAC对肺组织内质网应激相关蛋白mRNA表达的影响 RT-PCT结果显示，与对照组比较，ALI组肺组织XBP-1、ATF4和CHOP mRNA表达水平明显上调(P＜0.05);与ALI组比较，ALI+FAC组中XBP-1、ATF4和 CHOP mRNA表达明显下降(P ＜0.05)。见表1，图2。

表1 大鼠百草枯灌胃4 d后各组肺组织各指标含量比较(，n=10)Table 1 Contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(，n=10)

表1 大鼠百草枯灌胃4 d后各组肺组织各指标含量比较(，n=10)Table 1 Contents of SOD，CAT and MDA of lung tissues in different groups(，n=10)

与对照组比较，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01;与 ALI组比较，#P ＜0.05、##P ＜0.01

组别 SOD(U/mL) MDA(U/mL) CAT(U/mL) 肺组织CHOP蛋白表达CHOP XBP-1 ATF4对照组 300.26 ±35.69 3.26 ±0.24 5.78 ±1.28 0.19 ±0.060.23 ±0.07 0.22 ±0.09 0.11 ±0.04 ALI组 187.21 ±25.66＊＊ 5.04 ±0.36＊＊ 2.15 ±1.12＊＊ 0.64 ±0.19＊＊ 0.74 ±0.20＊＊ 0.97 ±0.27＊＊ 0.55 ±0.09＊＊ALI+FAC 组 260.17 ±45.23*## 3.99 ±0.27## 4.56 ±1.38*## 0.29 ±0.08*# 0.42 ±0.11*## 0.30 ±0.11## 0.25 ±0.08*#

图1 大鼠肺组织CHOP蛋白表达Figure 1 Expression of CHOP protein in lung tissues of rats in various groups detected by Western blot

图2 3组大鼠肺组织内质网应激相关蛋白mRNA的表达Figure 2 Expression of ATF4，XBP1 and CHOP mRNA of lung tissues in different groups detected by RT-PCR

2.4 FAC对肺组织中细胞凋亡的影响 TUNEL结果显示，ALI组肺组织阳性细胞数增多，凋亡细胞核呈棕黄色，对照组中仅见个别凋亡现象，而ALI+FAC组凋亡细胞明显减少。见图3。

图3 各组肺组织中细胞凋亡情况(TUNEL×100)Figure 3 Expression of apoptosis in lung tissue of rats(TUNEL×100)

2.5 FAC对肺组织形态学的影响 HE染色后光镜下对照组肺泡结构清晰，肺泡壁薄，肺泡间隔正常，肺泡腔内无炎性细胞浸润。ALI组光镜下见肺间质和肺泡水肿，可见大量炎性细胞浸润，部分可见蛋白渗出。ALI+FAC组肺组织内炎症细胞浸润、肺泡破坏程度较模型组明显减轻。见图4。

图4 各组大鼠肺组织病理学形态(HE×100)Figure 4 Histopathological pictures in different groups(HE×100)

3 讨 论

肺是百草枯中毒的主要靶器官，肺损伤是百草枯中毒后主要并发症及死亡原因。目前对百草枯中毒后肺损伤的机制仍不十分明确，而寻找有效方式来减轻百草枯中毒后肺损伤仍是十分艰巨的任务。越来越多的研究表明，ERS介导的细胞凋亡参与了很多中毒相关性疾病的发生发展，如有机磷农药、重金属、酒精及某些药物等［6－9］。内质网作为真核细胞中细胞钙离子储存及蛋白翻译合成的主要场所，对细胞应激反应起调节作用。而过度的ERS应激反应则可通过不同的途径引起组织细胞的损伤。前期研究中已发现百草枯中毒后器官损伤与氧化应激、细胞凋亡有密切关系［10－11］。肺组织具有丰富的内质网，故推测百草枯中毒后肺组织细胞的损伤可能与其诱导的强烈的ERS反应有关。目前国内外研究中对于百草枯中毒后肺损伤与ERS介导的细胞凋亡的关系罕见报道。

CCAAT增强子结合蛋白CHOP属于b-Zip转录因子之一，正常组织中CHOP表达非常低。当机体发生ERS时，将通过下列途径上调 CHOP表达［12－13］:通过活化PERK-eIF2a，引起转录因子ATF3和ATF4表达，其中ATF4将结合氨基酸调控元件，诱导CHOP表达;内质网跨膜蛋白IRE和ATF6细胞质活性部分进入核内，与CCAAT-N9-CCACG连接，启动CHOP转录与表达。而激活的CHOP可能通过Bcl-2表达的下调及谷胱甘肽的耗竭来活化Caspase 3，最终引起细胞凋亡［14－15］。沙苑子为豆科植物扁茎黄芪干燥成熟的种子。在近年的研究中发现其对肝、肾、免疫系统及循环系统均有一定的药理效应。FAC为沙苑子的乙醇提取物，其主要有效成分是黄酮，其主要的药理作用为抗脂质过氧化、抗肝纤维化、诱导白血病细胞凋亡、调节机体免疫功能及改善血液流变学［16－17］。但它对机体ERS的影响尚未见报道。

本研究通过肺组织TUNEL染色结果分析发现，FAC干预后大鼠肺组织细胞凋亡较ALI组明显减少，肺组织中氧化应激明显受到抑制(MDA水平明显降低，SOD和CAT则明显升高);同时肺组织病理改变明显减轻，表明FAC可以增强抗氧化酶的活性。因此说明FAC对百草枯中毒后肺组织损伤具有保护作用，且与其抗氧化应激密切相关。

为进一步明确百草枯中毒肺损伤机制及FAC肺保护的作用机制，本实验研究了ERS相关基因CHOP、ATF4和XBP-1在各组大鼠肺组织中的表达情况。RT-PCR结果表明，百草枯诱导大鼠肺损伤后肺组织中CHOP、XBP-1和ATF4 mRNA表达明显上调，而FAC干预后上述基因表达则明显下调。Western blot结果也表明FAC能降低百草枯中毒后肺组织中CHOP蛋白的表达。综合上述研究结果可提示FAC对大鼠百草枯中毒后肺损伤保护效应可能与减轻ERS反应有关。

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