二烯丙基二硫对人小细胞肺癌NCI-H446细胞裸鼠移植瘤生长的影响

刘德勇，张庆丽，赵其辉，彭和人，谢海龙

0 引 言

肺癌病死率居于恶性肿瘤首位，5年生存率低。小细胞肺癌约占肺癌发病率的20%，其恶性程度高，易发生复发转移，且预后差，对化疗、放疗敏感，但易发生耐药性［1－2］。目前主要通过化疗延长患者的生存时间，但不良反应较大，如何改善患者的生活质量对于小细胞肺癌的治疗具有十分重要的意义。

大蒜的主要成分二烯丙基二硫(diallyl disulfide，DADS)是一种脂溶性有机硫物质，也是大蒜发挥药用价值的主要成分［3］。近几年来，DADS在多种肿瘤治疗研究中取得了显著的成果，例如鼻咽癌、食管癌、胃癌、肝癌、结肠癌、乳腺癌、前列腺癌、白血病等［4－11］，且大蒜的价格低廉，是一种非常具有开发潜力的抗肿瘤药物。本实验室经过前期研究已经证实，DADS对体外培养的人小细胞肺癌NCI-H446细胞的生长具有明显的抑制作用，并且经DADS处理后的NCI-H446细胞形态亦会发生明显变化，但具体的作用机制尚不清楚。

本研究在前期工作的基础上，建立NCI-H446细胞裸鼠移植瘤动物模型，探讨DADS对肺癌细胞移植瘤的生长抑制作用，并研究其作用机制，为DADS未来作为新型抗癌药物应用于临床，提供一定的理论和试验依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 健康BALB/c-nu裸鼠，雄性，体重16～22g，7周龄(购自北京维通利华实验动物技术有限公司)。动物合格证号:SCXK(京)2007－0001，SPF环境下饲养。所有小鼠置于温度(22±2)℃、湿度(60±5)℃、12 h明暗交替环境中。人小细胞肺癌NCI-H446细胞(购自上海中科院细胞中心)，于含有10%小牛血清的RPMI-1640培养基中培养。DADS(购自Fluka公司)，相对分子质量146.28，纯度80%，含10% ～20%DAS。DADS与Tween 80按1∶2的比例混合溶解后，用等渗盐水稀释100倍，震荡混匀，于－20℃冰箱中保存备用。RPMI-1640培养基(购自美国GIBCO公司)，小牛血清(由杭州四季青生物工程公司提供)，碘化丙啶(PI)(购自Sigma公司)，吖啶橙(AO)(购自美国Sigma公司)，PCNA抗体、ECL检测试剂盒(购自Sant a Cruz公司)，BCA蛋白定量试剂盒(购自Pierce公司)，Epics XL流式细胞仪(Coulter公司生产)。

1.2 实验方法

1.2.1 裸鼠成瘤 取裸鼠25只，选取右侧后肢背侧，皮下接种2×106个处于对数生长期的NCI-H446细胞。成瘤裸鼠按随机列表法分为5组，包括阳性对照组、阴性对照组、DADS 20 mg/kg组、DADS 60 mg/kg组、DADS 180 mg/kg组;阳性对照组给予顺铂(DDP)浓度66 mg/kg;阴性对照组给予等渗盐水。隔天1次，皮下注射给药，连续10次。

绘制生长曲线:肿瘤长大一定体积后按组给药，测量移植瘤的最大径(a)及最小径(b)，然后按公式V=ab2/2，计算肿瘤体积(V)，并计算每组动物移植瘤体积的平均值，绘制生长曲线。实验结束后，剥离肿瘤，并称量移植瘤重量，每组取部分移植瘤组织保存于－80℃超低温冰箱，其余于4%甲醛中固定保存。抑瘤率计算公式:

抑瘤率=(1－治疗组瘤重/对照组瘤重)×100%

观察记录各组裸鼠肿瘤的形态和大小，将每个肿瘤剥离并称重，切取部分组织放入10%甲醛中固定，用于HE染色和免疫组织化学试验。余下组织冷冻于－20℃冰箱，用于流式细胞术检测。

1.2.2 组织形态学观察 移植瘤固定于4%甲醛中，24 h后，脱水、石蜡包埋、切片。HE染色后，光学显微镜下观察移植瘤细胞的形态变化。

1.2.3 流式细胞术 从－80℃冰箱取出移植瘤组织，研磨成均匀浆液，收集细胞到离心管中，然后以离心半径13.5 cm、1000 r/min离心5 min，弃去培养液后，再用预冷的PBS溶液重悬细胞，以离心半径13.5 cm、1000 r/min离心 5 min。组织匀浆过滤，去除残渣，再将细胞重悬于PBS中，以离心半径13.5 cm、2000 r/min离心10 min，弃去上清。重悬细胞，加入2mL 0.25%的胰蛋白酶，搅拌10min混匀。用500目不锈钢网过滤成细胞悬液，加入2 mL含有1%新生牛血清的PBS，混匀，以离心半径13.5 cm、1000 r/min离心5 min，弃去上清。将细胞再重悬入0.2 mL的PBS中，加入2 mL 4℃预冷的70%乙醇，固定细胞，放入冰盒送检。

将用乙醇固定的细胞离心洗涤，弃去固定液，再用3mL PBS重悬，400目过滤网网过滤1次，离心半径13.5 cm、1000 r/min 离心 5min。加入 200 μL 1 mg/kg的 RNAase(RNA 酶)50 μL 消化(浓度为 0.5 g/L)，37 ℃ 水浴 30 min，后用 Coulter DNA prepReagents Kit进行碘化丙啶(prooidium iodide，PI)染色，振荡混匀，4℃冰箱避光染色30 min。300目尼龙网滤过，用Epics XL流式细胞仪检测，检测细胞周期中G1、S、G2/M期细胞百分率和DNA含量(利用细胞仪自带DNA分析软件分析)。

1.3 统计学分析 采用SPSS 12.0软件进行统计分析，定量资料采用均数±标准差()表示，组间两两比较采用LSD法，率的比较采用χ2检验方法，以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 裸鼠的生长及成瘤情况 在实验过程中，裸鼠饮水、进食情况正常，无逃逸，其中阳性对照组、DADS 60 mg/kg组、DADS 180 mg/kg组组各有1只裸鼠死亡。NCI-H446细胞接种7 d后，形成肉眼可见的移植瘤，14 d后肿瘤生长到0.1 cm3左右。裸鼠移植瘤境界清晰，有包膜，表面凸凹不平，有结节。阴性对照组肿瘤生长速度较快，体积较大，其他4组移植瘤生长速度有所减慢，其中以DADS 180 mg/kg组最为显著，瘤体积较小。

2.2 DADS对移植瘤的抑制作用 阴性对照组的肿瘤生长速度较快，体积较大，实验结束时有1只裸鼠肿瘤表面形成溃疡。DADS 180 mg/kg组肿瘤生长速度较阴性对照组明显减慢;其余组肿瘤在用药后，体积都有明显缩小。根据实验过程中记录的瘤体积数据，绘制肿瘤生长曲线，可见不同浓度DADS对移植瘤的生长均有抑制作用。见图1。实验结束后，将移植瘤剥离，称重后计算抑瘤率，各组的抑瘤率与阴性对照组相比，差异均具有统计学意义(P＜0.01)，且抑瘤率随DADS浓度的增加而升高;与阳性对照组比较，DADS 180 mg/kg组抑瘤率差异有统计学意义(P＜0.05)。与DADS 20 mg/kg组比较，DADS 60 mg/kg组、180 mg/kg组抑瘤率差异有统计学意义(P ＜0.05)，而 DADS 60mg/kg组、180mg/kg组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

图1 不同浓度DADS治疗后裸鼠移植瘤的生长情况Figure 1 The growth of xenograft tumors which treated with different concentration DADS

表1 各组裸鼠移植瘤体积和瘤重比较()Table 1 The volume and weight of xenograft tumors treated with DADS()

表1 各组裸鼠移植瘤体积和瘤重比较()Table 1 The volume and weight of xenograft tumors treated with DADS()

与阴性对照组比较，*P＜0.05;与阳性对照组比较，#P＜0.05;与 DADS 20 mg/kg组比较，△P ＜0.05

组别 n 成瘤率(%) 平均瘤体积(cm3)平均瘤重(g) 抑瘤率(%)5 100 1.17±0.13 0.128 0阳性对照组 4 100 0.64±0.21 0.073 43.0*DADS 20mg/kg组 5 100 0.68±0.22 0.076 40.6*DADS 60mg/kg组 4 100 0.45±0.17 0.060 53.1＊△DADS 180mg/kg组 4 100 0.21±0.20 0.043 66.4＊△#阴性对照组

2.3 移植瘤形态学改变 HE染色后，利用光学显微镜观察，阴性对照组瘤细胞密度大，瘤细胞排列紊乱，瘤细胞的形状主要为圆形或椭圆形，细胞核的异型性大，染色深，核仁大且明显，核分裂像增多，核浆比例大，可见明显的细胞坏死。而DADS处理组，细胞密度较小，瘤细胞排列相对较规则，瘤细胞的形状主要是多边形或梭形，瘤细胞核异型性小，核呈圆形淡染，核仁小而不明显，核分裂像减少，核浆比例较小。见图2。

2.4 流式细胞术检测细胞周期分布 利用流式细胞术方法检测显示:与阴性对照组相比，各组移植瘤的细胞周期分布发生了显著改变，处于G2/M期的细胞数目显著增多，差异有统计学意义(P＜0.01)，各DADS处理组间差异无统计学意义(P＞0.05)。见表2。

表2 DADS对裸鼠移植瘤细胞周期的影响(n)Table 2 Effect of DADS on cell cycle in xenografts tumors(n)

图2 裸鼠移植瘤的细胞形态(HE×40)Figure 2 The morphology of xenografts tumors(HE×40)

3 讨 论

DADS是从大蒜中提取的主要成分，也是大蒜发挥抗肿瘤作用的主要物质。许多研究显示DADS对多种肿瘤都具有抑制作用［4－11］。我们前期的研究证实，DADS能抑制体外培养的NCI-H446肿瘤细胞增殖［12］。本实验研究证实，DADS在体内能抑制NCI-H446肿瘤细胞移植瘤的生长。

G1期、S期和G2/M期是细胞周期调控的主要时期，细胞周期的调控主要是通过各种调控因子的激活和灭活完成的［12－13］。细胞周期调控过程中，尤其是G1/S期和G2/M期的调控在细胞发生癌变的过程中起着非常重要的作用［14－19］。本研究建立了人小细胞肺癌裸鼠移植瘤模型，观察到DADS对移植瘤的细胞周期有明显的阻滞作用，并且流式细胞仪检测显示:与对照组相比，各处理组裸鼠移植瘤的细胞周期均发生了显著的改变，G2/M期细胞数目明显增多，提示DADS能改变人肺小细胞肺癌裸鼠移植瘤的细胞周期分布，能将细胞周期阻滞于G2/M期。DADS 180 mg/kg组和阳性对照组阻滞作用最明显。

综上所述，DADS能抑制人小细胞肺癌NCIH446细胞裸鼠移植瘤的生长，抑制机制可能与诱导细胞凋亡、细胞周期的调控。本研究为DADS未来应用于临床治疗人小细胞肺癌，提供了一定的实验和理论依据。

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