多配体蛋白聚糖-4脱落在瓣膜性心房颤动患者左心房炎症反应中的作用

原晖华，吴 韩，李 苒，谢 峻，李冠男，陈琴花，徐 标

0 引 言

房颤是老年人最常见的心律失常，房颤的发病率会随着年龄的增大而增加，并可导致严重的心功能不全及血栓形成，特别是左心房内栓子脱落引起脑梗死［1］。房颤的发生发展与炎症及氧化应激反应有关，局部炎症可致心房结构发生改变，为房颤的发生奠定了结构基础，但房颤时加速局部组织炎症反应的因素尚不清楚［2－5］。多配体蛋白聚糖-4(Syndecan-4)是硫酸乙酰肝素类的跨膜转运蛋白多糖Syndecan家族的成员之一，在伤口愈合、炎症、血管新生等方面起重要调节作用［6］。研究表明病理条件下Syndecan-4胞外段可从细胞膜上脱落，参与肺脏和心脏炎症反应过程的调控［7］。本研究观察Syndecan-4脱落在瓣膜性房颤患者左心房炎症反应中的作用，以期发现房颤时心房局部炎症反应发生发展的潜在机制。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2011年10月至2013年10月在我院心胸外科住院的60名拟择期行瓣膜置换术或瓣膜成形术的瓣膜病患者，病变部位包括二尖瓣、主动脉瓣病变或双瓣膜病变。分为窦性心律(sinus rhythm group，SR)组、阵发性房颤(paroxysmal atrial fibrillation group，PaAF)组和持续性房颤(persisitent atrial fibrillation group，PeAF)组，每组各20例。对照组选取先天性心脏病但无瓣膜病变及房颤的患者10例。排除标准:①家族性阵发性房颤患者;②有影响房颤发生的疾病史(如甲状腺功能亢进症)患者;③肺动脉疾病、心肌病、肾脏疾病患者;④二次开胸手术患者。记录患者基本临床资料，并于术前常规行二维心脏彩超检查。房颤分类参考2010年欧洲心脏病学会房颤管理指南定义。本研究严格遵循1975年《赫尔辛基宣言》(1983年修订)所规定的操作规程，并且得到了南京大学医学院附属鼓楼医院伦理委员会批准，所有患者均签署了知情同意书。

1.2 主要试剂与仪器 BCA蛋白定量试剂盒购自美国Pierce公司，Syndecan-4抗体购自美国BioSciences公司，诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)和高迁移率族蛋白 B1(high mobility group protein B1，HMGB1)抗体购自美国Bioword公司，β肌动蛋白(β-actin)抗体购自美国Santa Cruze公司。辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)标记二抗为美国Santa Cruze公司产品，超敏化学发光试剂盒由美国GE公司提供。HE染色试剂盒购自上海碧云天生物技术研究所。小型垂直电泳仪、电转化仪、聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜和凝胶图像分析系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.3 方法

1.3.1 心脏左心房组织标本的采集和储存 手术开胸后，在心脏体外循环建立之前采集少量左心房组织样本。小部分用4%甲醛固定做组织病理HE染色，其余部分则迅速放入液氮中，随即转至－80℃冰箱中保存待测。

1.3.2 左心房组织 iNOS、HMGB1和 Syndecan-4 蛋白表达水平检测 采用Western blot检测:取左心房组织，磷酸缓冲液洗涤，剪碎后加入RIPA裂解液冰上裂解，匀浆，4℃条件下12000×g离心10 min，取上清使用BCA法测定蛋白浓度后置入100℃水浴5 min，使用10%十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electropheresis，SDS-PAGE)并转移至PVDF膜上。以5%脱脂奶室温封闭1 h，向PVDF膜滴加抗Syndecan-4抗体(稀释度为1∶500)、抗HMGB1抗体(稀释度为1∶1000)、抗 iNOS 抗体(稀释度为 1∶1000)，以β-actin抗体作内参(稀释度为1∶2000)。用TBST缓冲液4次洗膜后加入连接有HRP的二抗，然后重复洗膜，加入发光剂显色。条带使用BioRad Quantity One imaging软件定量分析。

1.3.3 左心房组织HE染色 4%甲醛固定的组织标本石蜡包埋，并切成4 μm厚的切片。切片用二甲苯脱蜡，然后依次浸泡在含乙醇100%～75%浓度递降的溶液中，然后常规行HE染色。每张HE染色的石蜡切片观察5个不同视野。

1.4 统计学分析 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。计量资料用平均值±标准差()表示，计数资料用百分率表示。多个独立样本率(构成比)的比较使用χ2检验，多组独立定量资料使用方差分析(ANOVA)，两两比较采用Bonferroni法。双变量正态分布资料的相关性分析采用Pearson相关分析，等级资料相关性分析采用Spearman秩相关分析。以P≤0.05为有统计学意义。

2 结 果

2.1 基线临床特征 3组瓣膜病患者年龄、体重指数、心衰状态、射血分数(ejection fraction，EF)值及术前用药无明显差异。与SR组相比，PaAF组和PeAF组左心房内径明显增大(分别为P=0.006和P＜0.001)，且PeAF组左心房内径明显大于PaAF组(P ＜0.001)。见表1。

表1 60例瓣膜病患者的基线资料比较()Table 1 Baseline clinical characteristics of the patients studied()

表1 60例瓣膜病患者的基线资料比较()Table 1 Baseline clinical characteristics of the patients studied()

NYHA分级:纽约心脏病学会(NYHA)心功能分级;与SR组比较，*P＜0.05;与PaAF组比较，#P＜0.05

参数 SR组(n=20) PaAF组(n=20) PeAF组(n=20) F值或χ2值 P值9/11 12/8 11/9 0.938 0.626年龄(年) 52.5 ±7.0 52.4 ±8.3 53.6 ±8.6 1.112 0.336体重指数(kg/m2) 22.3 ±3.1 22.7 ±2.4 23.1 ±2.7 0.170 0.844 NYHA 分级Ⅰ/Ⅱ/Ⅲ/Ⅳ(n) 4/6/8/2 3/6/9/2 4/7/7/2 0.542 0.997超声心动图参数左心室舒张末期内径(mm) 51.9 ±6.3 53.4 ±6.1 55.3 ±8.4 0.509 0.604左心室收缩末期内径(mm) 40.2 ±4.4 43.8 ±8.1 44.4 ±6.9 0.744 0.480左心室射血分数(%) 52.8 ±4.2 50.1 ±4.4 49.7 ±3.9 0.744 0.480左心房内径(mm) 41.9 ±4.5 50.5 ±7.2* 58.7 ±6.7*# 38.873 ＜0.001左心房血栓(n) 0 1 0 2.231 0.328瓣膜病病因(n)风湿性/退行性变 13/7 15/5 17/3 2.133 0.344术前用药(n)洋地黄 12 15 16 2.134 0.344钙通道拮抗剂 3 3 4 0.235 0.889血管紧张素转化酶抑制剂男/女(n)1.078 0.583 6 5 8

2.2 患者左心房组织中Syndecan-4的表达水平与对照组相比，PaAF组和PeAF组Syndecan-4蛋白表达水平明显下调(分别为 P=0.013和 P=0.01);与SR组相比，PaAF组和PeAF组Syndecan-4也明显降低(分别为P=0.047和P=0.029)。但PeAF组和PaAF组之间差异无统计学意义(P=0.893)，对照组和SR组之间差异也无统计学意义(P=0.131)。见图 1，表 2。

图1 各组瓣膜病患者Syndecan-4蛋白表达水平Figure 1 Expression of the Syndecan-4 protein in the four groups of patients

表2 瓣膜病患者Western blot检测蛋白条带灰度值()Table 2 The gray level of the protein bands detected by Western blot()

表2 瓣膜病患者Western blot检测蛋白条带灰度值()Table 2 The gray level of the protein bands detected by Western blot()

与对照组比较，*P ＜0.05;与 SR 组比较，#P ＜0.05

组别 Syndecan-4/β-actin iNOS/β-actin HMGB1/β 0.99 ±0.09 1.02 ±0.12 0.46 ±0.06 SR 组 0.93 ±0.06 1.06 ±0.11 0.45 ±0.07 PaAF 组 0.72 ±0.1*# 1.61 ±0.10*# 0.63 ±0.05*#PeAF 组 0.60 ±0.12*# 1.67 ±0.08*# 0.95 ±0.10*#-actin对照组

Syndecan-4蛋白水平与 EF值、受累瓣膜数、NYHA分级的相关分析显示:在瓣膜病患者中，Syndecan-4蛋白水平和EF值无相关关系(r=－0.012，P=0.211);Syndecan-4 蛋白水平与受累瓣膜数无相关关系(r=0.001，P=0.488);Syndecan-4蛋白水平与NYHA分级负相关(r=－0.157，P=0.045)。进一步分析显示:NYHA分级Ⅲ、Ⅳ级患者左心房组织中的Syndecan-4蛋白水平与I级相比明显降低(分别为 P=0.001和 P ＜0.001)，Ⅲ、Ⅳ级与Ⅱ级相比差异有统计学意义(分别为P=0.037和P=0.005)，但Ⅰ级和Ⅱ级之间、Ⅲ级和Ⅳ级之间差异均无统计学意义(分别为P=0.054和P=0.062)。见图 2。

2.3 房颤患者左心房组织中炎症反应 HE染色显示PaAF组、PeAF组比对照组、SR组有更多的炎症细胞浸润。见图3。

Western blot检测左心房组织中炎症标记物iNOS和HMGB1表达水平的结果显示:PaAF组和PeAF组iNOS表达水平较对照组明显升高(分别为P=0.011和P ＜0.001)，较SR 组也明显升高(分别为P=0.02和 P ＜0.001)，但 PaAF组和 PeAF组之间，对照组和SR组之间差异均无统计学意义(分别为P=0.065和 P=0.0783);PaAF组和 PeAF组HMGB1表达水平较对照组明显升高(分别为P=0.018和 P ＜0.001)，较 SR 组也明显升高(分别为P=0.023 和 P=0.009);与 iNOS 不同的是，HMGB1表达水平PeAF组较PaAF组有较明显的升高(P=0.027)。见图 4，表 2。

图2 Syndecan-4蛋白水平和各组瓣膜病患者临床参数之间的相关关系Figure 2 Correlation of the expression of Syndecan-4 with other clinical parameters of the four groups of patients

图3 各组瓣膜病患者炎症细胞浸润(HE×200)Figure 3 Infiltration of inflammatory cells in the four groups of patients by HE staining(HE×200)

图4 各组左心房组织中的炎症标记物表达Figure 4 Expressions of inflammation markers in the left atrial tissue of the four groups of patients

3 讨 论

炎症反应与房颤的发生、发展、复发及持续有关，研究表明炎症因子 IL-6、IL-8、C反应蛋白(C reactive protein，CRP)、肿瘤坏死因子 α(tumor necrosis factor alpha，TNF-α)和单核细胞趋化蛋白-7(monocyte chemotactic protein-7，MCP-7)等参与房颤的发生与发展［8］。iNOS是一种早期的炎症标记物，参与诱导促炎细胞因子释放和氧化应激的发生过程［9］。HMGB1是一种核蛋白质，由坏死细胞以及活化的免疫细胞释放至细胞外，具有细胞因子的活性，继之启动免疫反应和引发炎性反应，是新发现的炎症晚期细胞因子。有研究发现，与对照组相比，HMGB1在房颤患者血清中浓度明显升高［10］。本研究观察到:与窦性心律组相比，持续性房颤组和阵发性房颤组患者的左心房组织中HMGB1和iNOS均表达上调，且HMGB1含量持续性房颤组高于阵发性房颤组。上述结果提示HMGB1和iNOS可能通过诱导炎症反应参与房颤的发生，但房颤时引起炎症反应增加的原因尚不清楚。

Syndecan是大多数哺乳动物细胞表面主要的硫酸肝素类蛋白多糖，在炎症反应、血管新生、组织重构等防御机制中发挥重要作用。大量研究表明Syndecan可监控炎症的进程，Rodrigo等［11］报道 Syndecan-1敲除小鼠随着IL-6表达上调，表现出炎症反应增强和恢复功能受损;Wang等［12］使用葡聚糖硫酸钠诱导建立小鼠大肠炎模式，注射低分子量肝素后表现出抑制小鼠Syndecan-1的脱落而缓解大肠炎症;我们前期的研究发现过表达Syndecan-4可减轻心梗后炎症反应［7］;而Syndecan-4缺乏小鼠注射脂多糖后，转化生长因子-β1功能受损，表现出较高的死亡率［13］;这些证据表明Syndecan-4低表达或脱落能够促进不同器官的炎症反应。本研究发现房颤患者较对照组Syndecan-4表达明显降低，伴随炎症细胞的浸润程度增加，且NYHA分级Ⅲ、Ⅳ级的患者Syndecan-4表达较Ⅰ、Ⅱ级患者明显降低，差异有统计学意义。与本研究结果相似，Strand与Takahashi等［14－15］观察到衰竭的心脏组织及血清中Syndecan-4的脱落增加，提示房颤和心衰发生过程中Syndecan-4可能有相同的调节机制。

综上所述，房颤患者左心房组织中Syndecan-4表达明显下降伴随大量的炎症细胞浸润以及炎症标记物HMGB1和iNOS的高表达，提示Syndecan-4脱落可能是房颤患者左心房组织中炎症反应发生和发展的潜在机制。

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