傅里叶变换红外光谱应用于难治性细菌性阴道病诊断研究

2014-09-26李宁谭珍媛陈铁寓等

现代仪器与医疗 2014年5期

关键词：诊断

李宁　谭珍媛　陈铁寓等

[摘要] 利用一维傅里叶变换红外光谱法及二维红外相关光谱法对难治性细菌性阴道病患者与正常妇女分泌物进行研究，探讨其一维、二维红外光谱特征及其差异，为快速诊断难治性细菌性阴道病提供依据。实验结果表明，病患者分泌物的一维红外光谱主要具有如下特征：与蛋白质、核酸、肽聚糖相关红外吸收峰的峰强比I3380/I1460和I1550/I1460，I1080/I1460，I1026/I1460明显升高，表明分泌物中蛋白质、核酸、壳聚糖的含量升高，而与脂类相关的I2925/I1460则低于正常值表明分泌物中脂类含量降低。此外，患者酰胺I带波数明显降低，显示其蛋白质二级结构组成与正常人的有明显差异；结合二阶导数光谱和二维红外光谱可以将患者与正常人的分泌物完全区分开来。初步研究表明，FT-IR有可能为快速诊断难治性细菌性阴道病提供一种新的方法和技术。

[关键词] 难治性细菌性阴道病；诊断；傅里叶红外，二维红外

中图分类号：R711.31 O657 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2014）05-001-04

[Abstract] The aim of the research was to establish the vaginal secretion basis for the recurrent BV by exploring a method to obtain 1D and 2D FT-IR spectrum of the secretion sample with FT-IR spectroscopy，and probing the characteristic features of recurrent BV compared with the normal ones. The results showed that the FT-IR spectrum of recurrent BV secretion was different from normal one： The ratio of I3380/I1460 and I1550/I1460，I1080/I1460，I1026/I1460 related to the protein，nuclear acid and chitosan were higher than in the normal one，which indicated their concentration increased in the secretion. The ratio of I2925/I1460 related to the lipid was lower than in the normal ones，which showed the relative quantity was less in the morbid secretion. Moreover，the amide band I of the patients obviously moved to lower wavenumber also indicated the secondary structure of related protein was different. Further research on the second derivative and 2D of FT-IR spectrum also unveiled great difference between the morbid and normal secretion. It can be concluded that FT-IR could be a potential method for rapid diagnosis of recurrent BV.

[Key words] recurrent BV；diagnosis；FT-IR；2D FT-IR

引言

细菌性阴道病（bacterial vaginosis，BV）是阴道内正常菌群失调所致的一种混合性感染，感染菌群有加德纳菌、动弯杆菌、普雷沃菌、紫单胞菌、类杆菌等厌氧菌以及人型支原体[1]。难治性细菌性阴道病是指BV经规范化治疗3个疗程症状未见明显好转或1年发作4次以上者[2]。传统的难治性细菌性阴道病确诊过程需结合细菌培养、临床病历和复发史等进行判断，存在确诊周期长、主观性强的缺点[3]。患者往往无法及时获得针对性治疗，导致病情进一步恶化[4]，因此，急需建立一种快速而有效的诊断方法。

红外光谱（Infrared Spectrometry，IR）具有快速，简单可靠特点，可以在分子水平上反映组织和成分差异，已成为生物医学领域的热门研究对象，近年来国内外研究人员将其应用在蛋白质的二级结构测定[5-6]、恶性肿瘤的快速诊断[7-9]，并取得了一定成果，有望成为新的诊断技术。基于此，本研究着眼于傅里叶红外光谱法，通过分析细菌性阴道病患者与正常妇女分泌物在红外光谱上存在的差异，探索其用于难治性细菌性阴道病诊断上的可行性。

1 实验部分

1.1 标本取材和处理

阴道分泌物样品均来自广西南宁市妇女儿童医院，经菌群培养结合复发病史确诊为难治性细菌性阴道病的患者和作为对照组的正常妇女各20例，接受取样的对象均为年龄35-40岁的妇女。

样品采集后，立即用酒精固定，真空干燥48h后按干重1：20混合KBr，每个样品取200mg进行压片并测定红外光谱。

1.2 仪器和数据处理

（1） Perkin Elmer Spectrum100 傅里叶变换红外光谱仪，光谱范围4000～450 cm-1，分辨率2 cm-1，得到阳性组和对照组各样品的光谱图后，测量相应的阳性组与对照组各峰强比，数据用SPSS19.0软件进行t检验统计学分析，最后分别求出阳性和对照组平均光谱图。

（2）二阶导数光谱：导数光谱的获得采用Perkin Elmer公司Specturm v6.3.1操作软件，平滑点数为13，分析范围：1350～850 cm-1。

（3）二维相关红外光谱： Perkin Elmer热扰组件，升温范围：60～85℃，升温速率1℃/1min，每隔5℃测定一次红外光谱图。二维相关红外光谱的获得采用Perkin Elmer公司的Transform二维相关分析软件以及Matlab 5.7分析软件，分析范围：1200～850 cm-1。

2 结果与分析

2.1 阳性组与对照组分泌物的一维红外光谱分析比较

（1）与蛋白质相关的谱带：蛋白质在红外光谱区主要在3380cm-1，1650cm-1和1550cm-1处有吸收。其中3380cm-1附近的宽高峰由N-H单键的振动引起，此外蛋白质上的O-H伸缩振动也在此有吸收。1650cm-1左右的尖吸收峰为蛋白质的酰胺（CONH2）I带，由酰胺的羰基伸缩振动引起。1550cm-1左右的吸收峰为蛋白质的酰胺II带，由C≡N伸缩以及C-H的弯曲振动引起。从表1可以看出，来自患者的样品其红外光谱的峰强比I3380/I1460以及I1550/I1460明显升高，表明蛋白质相对含量升高，其原因可能是患者的免疫系统受到病菌刺激，产生强烈的吞噬作用以及分泌各种蛋白酶。此外，患病组样品1650cm-1左右酰胺I带的吸收峰比对照组的向低波数移动了5 cm-1左右，酰胺I带为多个氨基酸残基重叠而成的峰，根据文献报道，表明蛋白质二级结构的构成比例发生了变化，向低波数位移的幅度越大，β-折叠和β-转角比例也越多，相应的α-螺旋所占的比例越小[10-11]。

（2）与脂类相关的谱带：图谱上与脂类相关的峰主要是2926cm-1，2854cm-1，1460cm-1以及1384cm-1。从表1可以看出，在患者的分泌物样品中，I2925/I1460比值与正常人相比明显降低，这表明脂类物质含量减少。由于脂类可为机体提供能量，机体受到感染时，免疫系统吞噬、呼吸爆发等活动加剧，新陈代谢的活动增加，这种情况下脂类物质将很难累积。

（3）与磷酸相关谱带：图谱上与核酸类相关的峰主要是1238cm-1、1079cm-1，分别由P=O双键的弯曲振动以及P-O单键的弯曲振动引起。从表1可以看出，患者分泌物I1080/I1460较正常分泌物有大幅度的升高，表明磷脂及核酸物质在增加。在机体对抗病菌过程中，人体免疫细胞以及病菌都会大量消亡，细胞死亡后大量构成细胞膜的磷脂物质将被释放出来。此外，被感染部位的免疫细胞以及细菌分裂都比正常的迅速，因此遗传物质的含量明显增加。

（4）与糖类相关的谱带：细菌具有细胞壁，主要成分是肽聚糖，这是细菌区别于人体细胞的重要标志，肽聚糖（peptidoglycan，其骨架是由N-乙酰葡萄糖胺和N-乙酰胞壁酸通过β-1，4糖苷键交替相联而组成的线状聚糖链）在指纹区1026 cm-1通常有比较明显的吸收峰。细菌被破坏后，肽聚糖被释放出来，容易在红外图谱上呈现吸收峰[12]。从表1看，患者分泌物I1026/I1460强度几乎为正常人的3倍，从图1上看，患者平均光谱1026 cm-1处的吸收峰尖锐而明显，强度甚至大于1079cm-1处的核酸吸收峰，而形成鲜明对比的是对照组在此处的吸收几乎被埋没。

2.2 阳性组与对照组分泌物的二阶导数谱分析比较

为了更直观地表示出难治性细菌性阴道病患者与正常妇女分泌物在指纹区的差别，我们对二者的平均光谱进行二阶取导，二阶导数谱图见图2、图3。在1350-850cm-1的光谱区域内，阳性组与对照组分泌物有明显区别，前者在1195 cm-1、1437 cm-1、1008 cm-1、948 cm-1处出峰，而后者分别位移至1190 cm-1、1435cm-1、1011 cm-1、950 cm-1处。此外前者还在868 cm-1处多出1个峰。在1350～1150cm-1的区域内，患者的分泌物在1295 cm-1、1198 cm-1、1164 cm-1处有明显的3个峰，而正常妇女分泌物在这一区域的二阶导数谱没有出峰，谱线接近平滑，通过二阶导数红外光谱已经能将二者初步鉴别，下面将使用二维红外图谱对二者进行深入鉴别。

2.3 阳性组与对照组分泌物的二维红外光谱分析比较

难治性细菌性阴道病患者与正常妇女分泌物在850～1200cm-1范围内的二维相关红外光谱见图4、图5。图中左边为二者的同步二维红外平面相关谱，右边为对应的同步立体相关谱。可以看出，正常妇女分泌物在同步谱中的对角线位置出现5个自动峰，分别在850cm-1、875cm-1、970 cm-1、1000cm-1、1025cm-1处，其中1000cm-1、1025cm-1处的自动峰强度最大，而患者分泌物在850～1200cm-1区域对角线仅850 cm-1、970cm-1处有较弱的自动峰。此位置主要为酰胺及其衍生物的C-N弯曲振动吸收区域。通过二维谱图，说明患者分泌物中的酰胺C-N弯曲振动随温度升高的变化远弱于正常分泌物。

3 结论

难治性细菌性阴道病的诊断一直是临床医学的难题之一。红外光谱可以快速简便地从分子水平检测组织样品，从物质的组成和分子结构方面提供依据，配合菌群培养诊断技术，可以弥补传统检测技术的不足。本课题研究采取临床取样后KBr压片获取红外光谱的方法，对难治性细菌性阴道病患者与正常妇女分泌物的光谱特点进行了研究。二者在红外光谱上有着较大不同，不论从物质构成、类型等方面均有较大差异，结合二阶导数、二维红外相关光谱更能直观地体现患者分泌物与正常人的不同，红外光谱的操作也很方便。初步研究结果表明，傅里叶变换红外光谱分析可能成为一种诊断难治性细菌性阴道病的新方法。

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