高效液相色谱分析筛查地中海贫血32638例分析

李东明　韦媛　何升等

[摘 要] 目的：评价高效液相色谱分析在地中海贫血筛查与诊断中的价值。方法：采用高效液相色谱分析技术对32638例标本进行血红蛋白分析，3678例标本进行了α-或β-地中海贫血基因检测，ROC曲线分析HbA2和HbBarts的筛查截断值。结果：32638例标本中检出地中海贫血和血红蛋病共4028例（12.34%）。经基因确诊β-地中海贫血重型8例、中间型34例和轻型2473例，以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654、CD26、CD71-72和IVS-I-1及其复合最为常见，占98.73%。高效液相色谱技术筛查HbH病和HbCS的准确性为100%，以HbA2>3.8筛查轻型β-地中海贫血的灵敏度和特异性为96.84%和98.71%，以Hb Barts>58.1%筛查重型α-地中海贫血的灵敏度和特异性均为100%。结论：本地区地中海贫血发生率较高，高效液相色谱技术能有效筛出β-地中海贫血和重型α-地中海贫血，筛查HbH病和HbCS的准确性较好。

[关键词] 高效液相色谱；地中海贫血；筛查

中图分类号：R714.55 文献标识码：A 文章编号：2095-5200（2014）05-038-03

[Abstract] Objective： To evaluate the application of high performance liquid chromatographic （HPLC） in screen of thalassemia（thal）. Methods： Hemoglobin （Hb） electrophoresis was done by HPLC in 32638 cases，and DNA analysis of 3678 samples were further examined by PCR combined with Agarose electrophoresis and reverse dot blot. Results： Out of 32638 cases，There were 4028 cases detected as thal or abnormal Hb disease. By NDA analysis，8 were β-thal major，34 were β-thal intermedia，and 1594 were heterozygote of β-thal. The main gene types were CD41-42，CD17，-28，IVS-Ⅱ-654，CD26，CD71-72，IVS-I-1 and the Composite genotype of them，and which accounted for 98.71%. The accuracy of screening Hb H disease and Hb CS was 100%. To diagnose heterozygote of β-thal by HbA2 above 3.8%，the sensitivity and specificity were 96.84% and 98.73%. The optimal cutoff values of Hb Barts for screening of α-thal major were 58.1%，and the sensitivity and specificity were 100%. Conclusion： The population in Guangxi are at high risk of thal. HPLC is an effective screening method for β-thal and α-thal major，and it was exact to screen Hb H disease and Hb CS.

[Key words] High performance liquid chromatographic；thalassemia；screening

地中海贫血（简称地贫）是广西最常见血液遗传病，人群中α-、β-地贫和血红蛋白病发生率较高分别为7.80%～17.51%，6.43%～7.53%，0.38%～0.52%[1-3]，这可能导致重型α-地贫（Hb Bart's症）、中间型或重型β-地贫患儿的出生。Hb Bart's症新生儿不能存活，且孕妇可能发生子癫、难产或产后出血等并发症；而中间型、重型β-地贫患儿缺少有效的治疗方法，绝大多数依靠输血维持生命，这给家庭带来沉重的负担[4]。产前干预是预防该类患儿出生的有效方法，产前筛查是对高风险夫妇进行产前诊断的基础，而出生后筛查可为地贫临床诊治提供依据。本研究采用高效液相色谱分析对本地区32638例就诊人群进行地贫筛查，对筛查阳性者进行基因诊断，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 对象

2011年10月～2013年9月，在广西壮族自治区妇产医院、妇幼保健院门诊就诊及住院的患儿30270例，男13535例，年龄2月～6.9岁，女16735例，年龄2月～5.8岁。另有因地贫等进行产前诊断的孕妇2368例，年龄18～45岁，孕18～36周。

1.2 方法

1.2.1 血红蛋白分析 抽取静脉血2mL于枸橼酸钠抗凝管或在B超引导下经腹行脐带穿刺术取脐静脉血2～3mL分别置于EDTA-K2和枸橼酸钠抗凝的2个试管。采用美国伯乐公司VARIANT高效液相色谱分析仪及配套试剂进行检测，HbA2>3.5%或HbF>4.0%为β-地贫表型阳性，出现HbH、HbCS及HbBart's等为α地贫表型阳性，HbA2>10%疑为HbE病。

1.2.2 地贫基因分析 采用Gap-PCR扩增结合琼脂糖凝胶电泳进行α-地贫缺失型：--SEA、-α3.7及-α4.2检测，罕见α-地贫泰国缺失型：--Thai采用Gap-PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测，引物由上海捷瑞公司合成，序列为F：CAC GAG TAA AAC ATC AAG TAC CCA CCC，R：TGG ATC TGC ACC TCT GGG TAG GTT CTG TAC C，扩增条件为：95℃预变性10min后进行35个循环扩增，每个循环包括98℃变性45s，62℃退火90s，72℃延伸3min，循环结束后72℃延伸5min；采用单管多重PCR结合反向点杂交技术检测3种α-地贫突变型：αCSα、αWSα及αQSα和17种中国人常见β-地贫基因突变，试剂盒购于深圳亚能生物公司，按试剂盒说明书进行操作、质量控制及结果判断。endprint

1.3 统计学方法

数据采用x±s表示，SPSS17.0软件处理，ROC曲线确定HbA2、HbBart's截断值。

2 结果

2.1 筛查情况

32638例标本中检出异常血红蛋白4028例，检出率为12.34%。其中30270例外周血中检出地贫和血红蛋白病表型3412例，检出率为11.27%，包括β-地贫2980例（9.85%）、α-地贫214例（0.70%）和血红蛋白病218例（0.72%）。2368例脐血中检出Hb Bart's 616例，检出率为26.01%。

2.2 β-地贫基因诊断

2859例外周血进行了β-地贫基因检测，检出β-地贫2515例。其中β-地贫重型8例、中间型34例，其HbA2水平表现为降低、正常或升高，但β-地贫合并HbE时HbA2水平明显增加，Hb F水平在不同年龄个体间差异较大，见表1。2515例中轻型β-地贫2473例，主要基因型依次为CD41-42（41.57%）、CD17（29.96%）、-28（7.36%）、IVS-Ⅱ-654（6.96%）、CD 26（5.54%）、CD 71-72（4.25%）和 IVS-I-1（3.07%），占98.71%，少见类型为-29、CD43、CD27-28、CD14-15和IVS-I-5，占1.29%；其表现为HbA2水平升高为主（3.1%～31.6%），伴或不伴HbF升高，以HbA2>3.8为临界值筛查的灵敏度和特异性为96.84%和98.73%。

2.3 α-地贫基因诊断

3 讨论

流行病学调查[1，4]显示本地区β-地贫的发生率较高，中间型和重型患儿在贫血患儿中占的比例很高。本研究采用高效液相色技术对30270例人群外周血进行血红蛋白分析，检出β-地贫表型2980例，检出率为9.85%。经基因分析确诊β-地贫2515例，基因型以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654 、CD 26、CD71-72和 IVS-I-1最为常见，占98.71%，与余永雄等[5]报道的97.3%相近。其中检出中间型和重型β-地贫42例，这表明在育龄人群中加强β-地贫产前筛查与诊断是非常必要的；其Hb特点为HbF明显升高，含量为9.3%～98.6%，Hb A2含量可降低、正常或升高。有96.84%轻型β-地贫者（包括HbE病）表现为HbA2升高，含量为3.1%～31.6%，结果显示高效液相色技术可有效的筛出β-地贫和HbE病等。

α-珠蛋基因缺失或突变可导致珠蛋白肽链合成减少或合成HbCS等异常血红蛋白，非α-链可形成HbBart's和HbH，通过Hb分析可有效地检出该类血红蛋白异常疾病。本研究对2368例脐血采用高效液相色技术进行Hb分析，其中603例经基因分析确诊α-地贫432例，其筛查灵敏度和特异性为90.66%和97.13%。以Hb Barts>58.1%筛查重型α-地贫具有较高的价值，其灵敏度和特异性均为100%；而筛查其他类型的α-地贫存在漏诊或误诊，尤其是这些类型α-地贫的分类必须依靠基因分析。高效液相色技术筛查HbH病和HbCS的特异性为100%，而其检出率却明显低于琼脂糖或毛细管电泳[6]，且不能检出Hb-WS H病，与Yin等[7]报道一致，这表明该方法对HbH病和HbCS的筛查存在较大的漏诊。值得注意的是本研究中2例外周血中检出HbH峰，而常规α-地贫基因检测为-α3.7/-α3.7和αCS/αCSα，最后诊断为泰国缺失型HbH病；1例脐带血HbBart's含量为32.6%，而基因分析为--sea/αα，不排除其他类型罕见HbH病。

综上，本地区地贫的发生率较高，采用高效液相色技术能有效地检出脐血中所有中间型、重型α-地贫和外周血中绝大多数β-地贫，而对其他类型的α-地贫存在漏诊或误诊。因此，临床应根据各项检测结果结合临床表现进行综合分析。

参 考 文 献

[1] Xiong F，Sun M，Zhang X，Cai R，et al. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China[J].Clin Genet，2010，78（2）： 139-148.

[2] 吕福通，谢丹尼，陈美佳，等. 地中海贫血干预的跟踪随访工作探讨[J].中国计划生育学杂志，2009，17（5）：308-308.

[3] 李东明，玉晋武，韦媛，等.高效液相色谱分析在HbE筛查中的应用价值[J].检验医学与临床，2013，10（7）：1808-1809，1811.

[4] Pan HF，Long GF，Li Q，et al. Current status of thalassemia in minority populations in Guangxi，China[J]. Clin Genet，2007，71（5）：419-426.

[5] 余永雄，黄丽，陈唯. 梧州地区β地中海贫血基因突变类型分析[J]现代预防医学，2013，40（4）：740-741.

[6] Liao C，Zhou JY，Xie XM，et al. Screening for Hb Constant Spring in the Guangdong Province，SouthChina，using the Sebia capillary electrophoresis system[J]. Hemoglobin. 2011，35（1）：87-90.

[7] Xiao-Llin Yin，Xin-Hua Zhang，Tian-Hong Zhou，et al. Hemoglobin H Disease in Guangxi Province，Southern China： Clinical Review of 357 Patient[J].Acta Haematol，2010，124（2）：86-91.endprint

1.3 统计学方法

数据采用x±s表示，SPSS17.0软件处理，ROC曲线确定HbA2、HbBart's截断值。

2 结果

2.1 筛查情况

32638例标本中检出异常血红蛋白4028例，检出率为12.34%。其中30270例外周血中检出地贫和血红蛋白病表型3412例，检出率为11.27%，包括β-地贫2980例（9.85%）、α-地贫214例（0.70%）和血红蛋白病218例（0.72%）。2368例脐血中检出Hb Bart's 616例，检出率为26.01%。

2.2 β-地贫基因诊断

2859例外周血进行了β-地贫基因检测，检出β-地贫2515例。其中β-地贫重型8例、中间型34例，其HbA2水平表现为降低、正常或升高，但β-地贫合并HbE时HbA2水平明显增加，Hb F水平在不同年龄个体间差异较大，见表1。2515例中轻型β-地贫2473例，主要基因型依次为CD41-42（41.57%）、CD17（29.96%）、-28（7.36%）、IVS-Ⅱ-654（6.96%）、CD 26（5.54%）、CD 71-72（4.25%）和 IVS-I-1（3.07%），占98.71%，少见类型为-29、CD43、CD27-28、CD14-15和IVS-I-5，占1.29%；其表现为HbA2水平升高为主（3.1%～31.6%），伴或不伴HbF升高，以HbA2>3.8为临界值筛查的灵敏度和特异性为96.84%和98.73%。

2.3 α-地贫基因诊断

3 讨论

流行病学调查[1，4]显示本地区β-地贫的发生率较高，中间型和重型患儿在贫血患儿中占的比例很高。本研究采用高效液相色技术对30270例人群外周血进行血红蛋白分析，检出β-地贫表型2980例，检出率为9.85%。经基因分析确诊β-地贫2515例，基因型以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654 、CD 26、CD71-72和 IVS-I-1最为常见，占98.71%，与余永雄等[5]报道的97.3%相近。其中检出中间型和重型β-地贫42例，这表明在育龄人群中加强β-地贫产前筛查与诊断是非常必要的；其Hb特点为HbF明显升高，含量为9.3%～98.6%，Hb A2含量可降低、正常或升高。有96.84%轻型β-地贫者（包括HbE病）表现为HbA2升高，含量为3.1%～31.6%，结果显示高效液相色技术可有效的筛出β-地贫和HbE病等。

α-珠蛋基因缺失或突变可导致珠蛋白肽链合成减少或合成HbCS等异常血红蛋白，非α-链可形成HbBart's和HbH，通过Hb分析可有效地检出该类血红蛋白异常疾病。本研究对2368例脐血采用高效液相色技术进行Hb分析，其中603例经基因分析确诊α-地贫432例，其筛查灵敏度和特异性为90.66%和97.13%。以Hb Barts>58.1%筛查重型α-地贫具有较高的价值，其灵敏度和特异性均为100%；而筛查其他类型的α-地贫存在漏诊或误诊，尤其是这些类型α-地贫的分类必须依靠基因分析。高效液相色技术筛查HbH病和HbCS的特异性为100%，而其检出率却明显低于琼脂糖或毛细管电泳[6]，且不能检出Hb-WS H病，与Yin等[7]报道一致，这表明该方法对HbH病和HbCS的筛查存在较大的漏诊。值得注意的是本研究中2例外周血中检出HbH峰，而常规α-地贫基因检测为-α3.7/-α3.7和αCS/αCSα，最后诊断为泰国缺失型HbH病；1例脐带血HbBart's含量为32.6%，而基因分析为--sea/αα，不排除其他类型罕见HbH病。

综上，本地区地贫的发生率较高，采用高效液相色技术能有效地检出脐血中所有中间型、重型α-地贫和外周血中绝大多数β-地贫，而对其他类型的α-地贫存在漏诊或误诊。因此，临床应根据各项检测结果结合临床表现进行综合分析。

参 考 文 献

[1] Xiong F，Sun M，Zhang X，Cai R，et al. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China[J].Clin Genet，2010，78（2）： 139-148.

[2] 吕福通，谢丹尼，陈美佳，等. 地中海贫血干预的跟踪随访工作探讨[J].中国计划生育学杂志，2009，17（5）：308-308.

[3] 李东明，玉晋武，韦媛，等.高效液相色谱分析在HbE筛查中的应用价值[J].检验医学与临床，2013，10（7）：1808-1809，1811.

[4] Pan HF，Long GF，Li Q，et al. Current status of thalassemia in minority populations in Guangxi，China[J]. Clin Genet，2007，71（5）：419-426.

[5] 余永雄，黄丽，陈唯. 梧州地区β地中海贫血基因突变类型分析[J]现代预防医学，2013，40（4）：740-741.

[6] Liao C，Zhou JY，Xie XM，et al. Screening for Hb Constant Spring in the Guangdong Province，SouthChina，using the Sebia capillary electrophoresis system[J]. Hemoglobin. 2011，35（1）：87-90.

[7] Xiao-Llin Yin，Xin-Hua Zhang，Tian-Hong Zhou，et al. Hemoglobin H Disease in Guangxi Province，Southern China： Clinical Review of 357 Patient[J].Acta Haematol，2010，124（2）：86-91.endprint

1.3 统计学方法

数据采用x±s表示，SPSS17.0软件处理，ROC曲线确定HbA2、HbBart's截断值。

2 结果

2.1 筛查情况

32638例标本中检出异常血红蛋白4028例，检出率为12.34%。其中30270例外周血中检出地贫和血红蛋白病表型3412例，检出率为11.27%，包括β-地贫2980例（9.85%）、α-地贫214例（0.70%）和血红蛋白病218例（0.72%）。2368例脐血中检出Hb Bart's 616例，检出率为26.01%。

2.2 β-地贫基因诊断

2859例外周血进行了β-地贫基因检测，检出β-地贫2515例。其中β-地贫重型8例、中间型34例，其HbA2水平表现为降低、正常或升高，但β-地贫合并HbE时HbA2水平明显增加，Hb F水平在不同年龄个体间差异较大，见表1。2515例中轻型β-地贫2473例，主要基因型依次为CD41-42（41.57%）、CD17（29.96%）、-28（7.36%）、IVS-Ⅱ-654（6.96%）、CD 26（5.54%）、CD 71-72（4.25%）和 IVS-I-1（3.07%），占98.71%，少见类型为-29、CD43、CD27-28、CD14-15和IVS-I-5，占1.29%；其表现为HbA2水平升高为主（3.1%～31.6%），伴或不伴HbF升高，以HbA2>3.8为临界值筛查的灵敏度和特异性为96.84%和98.73%。

2.3 α-地贫基因诊断

3 讨论

流行病学调查[1，4]显示本地区β-地贫的发生率较高，中间型和重型患儿在贫血患儿中占的比例很高。本研究采用高效液相色技术对30270例人群外周血进行血红蛋白分析，检出β-地贫表型2980例，检出率为9.85%。经基因分析确诊β-地贫2515例，基因型以CD41-42、CD17、-28、IVS-Ⅱ-654 、CD 26、CD71-72和 IVS-I-1最为常见，占98.71%，与余永雄等[5]报道的97.3%相近。其中检出中间型和重型β-地贫42例，这表明在育龄人群中加强β-地贫产前筛查与诊断是非常必要的；其Hb特点为HbF明显升高，含量为9.3%～98.6%，Hb A2含量可降低、正常或升高。有96.84%轻型β-地贫者（包括HbE病）表现为HbA2升高，含量为3.1%～31.6%，结果显示高效液相色技术可有效的筛出β-地贫和HbE病等。

α-珠蛋基因缺失或突变可导致珠蛋白肽链合成减少或合成HbCS等异常血红蛋白，非α-链可形成HbBart's和HbH，通过Hb分析可有效地检出该类血红蛋白异常疾病。本研究对2368例脐血采用高效液相色技术进行Hb分析，其中603例经基因分析确诊α-地贫432例，其筛查灵敏度和特异性为90.66%和97.13%。以Hb Barts>58.1%筛查重型α-地贫具有较高的价值，其灵敏度和特异性均为100%；而筛查其他类型的α-地贫存在漏诊或误诊，尤其是这些类型α-地贫的分类必须依靠基因分析。高效液相色技术筛查HbH病和HbCS的特异性为100%，而其检出率却明显低于琼脂糖或毛细管电泳[6]，且不能检出Hb-WS H病，与Yin等[7]报道一致，这表明该方法对HbH病和HbCS的筛查存在较大的漏诊。值得注意的是本研究中2例外周血中检出HbH峰，而常规α-地贫基因检测为-α3.7/-α3.7和αCS/αCSα，最后诊断为泰国缺失型HbH病；1例脐带血HbBart's含量为32.6%，而基因分析为--sea/αα，不排除其他类型罕见HbH病。

综上，本地区地贫的发生率较高，采用高效液相色技术能有效地检出脐血中所有中间型、重型α-地贫和外周血中绝大多数β-地贫，而对其他类型的α-地贫存在漏诊或误诊。因此，临床应根据各项检测结果结合临床表现进行综合分析。

参 考 文 献

[1] Xiong F，Sun M，Zhang X，Cai R，et al. Molecular epidemiological survey of haemoglobinopathies in the Guangxi Zhuang Autonomous Region of southern China[J].Clin Genet，2010，78（2）： 139-148.

[2] 吕福通，谢丹尼，陈美佳，等. 地中海贫血干预的跟踪随访工作探讨[J].中国计划生育学杂志，2009，17（5）：308-308.

[3] 李东明，玉晋武，韦媛，等.高效液相色谱分析在HbE筛查中的应用价值[J].检验医学与临床，2013，10（7）：1808-1809，1811.

[4] Pan HF，Long GF，Li Q，et al. Current status of thalassemia in minority populations in Guangxi，China[J]. Clin Genet，2007，71（5）：419-426.

[5] 余永雄，黄丽，陈唯. 梧州地区β地中海贫血基因突变类型分析[J]现代预防医学，2013，40（4）：740-741.

[6] Liao C，Zhou JY，Xie XM，et al. Screening for Hb Constant Spring in the Guangdong Province，SouthChina，using the Sebia capillary electrophoresis system[J]. Hemoglobin. 2011，35（1）：87-90.

[7] Xiao-Llin Yin，Xin-Hua Zhang，Tian-Hong Zhou，et al. Hemoglobin H Disease in Guangxi Province，Southern China： Clinical Review of 357 Patient[J].Acta Haematol，2010，124（2）：86-91.endprint