阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物的制备及药代动力学研究

殷香保，邬林泉，黄明文，罗志强，余新，黄俊，邢宏松

(南昌大学第二附属医院 普外科，江西 南昌 330006)

阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物的制备及药代动力学研究

殷香保，邬林泉，黄明文，罗志强，余新，黄俊，邢宏松

(南昌大学第二附属医院 普外科，江西 南昌 330006)

目的研究阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物的制备及药代动力学特点。方法以聚乳酸、壳聚糖为原料，采用复乳法制备阿霉素纳米微粒；以碳化二亚胺（EDC）为交联剂，采用分子交联技术将阿霉素纳米与VEGFR2单抗进行分子交联，制备阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物；ELISA法分析交联物的免疫性反应；再以SD大鼠为实验对象，研究交联物在动物体内的药代动力学特点。结果制备的阿霉素纳米在扫描电镜下为较均一的球形颗粒，粒径为（160±34）nm，载药量为和包封率分别为（30．15±3．5）%和（80．56±4．24）%。制备的阿霉素纳米-VEGFR2 单抗交联物保留了 VEGFR2 与 IV 型胶原酶以及表达IV型胶原酶的H 22细胞的免疫结合活性。交联物对阿霉素有良好的控制释放作用，能够有效降低血药峰浓度，并延长药物在血液中的滞留时间。结论阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物保留了VEGFR2单抗的免疫性，在动物体内具有良好的缓释性。

VEGFR2单抗；阿霉素；纳米微粒

本研究制备了阿霉素纳米与VEGFR2单抗的免疫交联物并对其理化性质进行了检测，现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 细胞培养 小鼠肝癌H22移植性肿瘤细胞在小鼠体内采取传代培养的方式培养细胞。

1.1.2 实验动物 SD大鼠，由南昌大学提供，合格证号：96-021。

1.1.3 药物与试剂 VEGFR2单抗以Sephadex G-200层析柱从大鼠杂交瘤腹水中纯化。阿霉素（Adriamycin，ADM）购自意大利Farmitalia公司。牛血清白蛋白、2-亚氨基四氢噻吩、多聚赖氨酸、IV型胶原酶、N-羟基琥珀酰亚胺基-间-(N-马来酰亚胺基) 苯甲酸酯等均购自Sigma公司；其他化学试剂均为光明试剂提供。

1.3.4 仪器 超净工作台（SW-CJ-1 D， 苏州净化设备有限公司），岛津UV 2120202型紫外可见分光光度计，CO2培养箱（SANYO MCO-15 AC），酶标仪（Heraeus Multifuge X1 R），低温高速离心机（时代北利，GT 10-1），扫描电子显微镜（卡尔·蔡司，EVO 18），动态光散射粒子分析仪（Cordouan，VASCO 2）。

1.2 方法

1.2.1 阿霉素纳米微粒（ADM-NP）的制备 初乳液的配制：适量ADM溶液在超声条件下与10 mL聚乳酸二氯甲烷溶液混合，随后加入少量混合乳化剂(Tween 80∶Span 80=6∶1)。初乳液随后在超声条件（10 min，80 w）下滴加到40 mL O-CMC水溶液中形成复乳液。复乳液在室温条件下电磁搅拌6 h，形成 ADM-NP混悬液。混悬液离心（3000 g×5 min），沉淀物用蒸馏水洗涤3次以上，得到的沉淀采用冷冻干燥方式得ADM-NP，储存备用[8]。

1.2.2 ADM-NP的检测 将适量的ADM-NP溶液滴在载玻片上，用吹风机将其吹干，放在喷金仪下做喷金处理，之后在环境扫描电镜下观察其形态。为了检测阿霉素纳米微粒的粒径大小，取适量稀释后的ADM-NP溶液在用动态光散射粒子分析仪于633 nm下观察。

1.2.3 ADM-NP的载药量和包封率计算 前处理：将ADM-NP溶解于PE中与水混悬，静置过夜，取水相溶液离心（3000 g×5 min）。上清液用HPLC测定其阿霉素的含量。载药量和包封率的计算公式分别为：载药量=（ADM-NP中ADM质量/ADM-NP质量）×100%，包封率=（ADM-NP中ADM质量/制备相应量纳米微粒所需ADM质量）×100%。

1.2.4 阿霉素纳米-VEGFR2交联物的制备 取制备好的ADM-NP溶于磷酸盐缓冲液中（0.5 M，pH 6.8）调整为5 g/L，加入4 g/L碳化二亚胺，4℃搅拌过夜。反应结束后，加入纯化后的VEGFR2单抗（5 g/L）反应4 h。然后再次加入EDC室温下反应1 h，随后在4℃下静置过夜。然后置截留分子量为10 kDa的透析袋中，于0.05 mol/L（pH 6.8）的PBS中充分透析16 h。透析完毕，得到VEGFR2单-ADM交联物。

1.2.5 细胞培养 用含10%BSA的RPMI 1640培养液培养人肝癌细胞系H22 cell，孵箱中传代培养条件为：37℃，5%CO2。用0.25%胰蛋白酶消化对数生长期的细胞，离心洗涤细胞，在倒置显微镜下将细胞数调整为6×105/mL。

1.2.6 ELISA法测定VEGFR 2-ADM交联物免疫性反应将IV型胶原酶溶解在PBS中配成10 mg/L溶液。按100 uL/孔包被96孔板，然后置于4℃过夜。H22 cell的固定：按200 uL/孔在96孔板中加入0.01%多聚赖氨酸，4℃静置过夜。除去包被液，并用PBS冲洗1～3次。取对数生长期的H 22细胞，按10×104细胞/孔加至 96孔板。离心（800×g，5 min）除去上清液，按50 uL/孔加入0.05%的戊二醛，反应20 min。96孔板用磷酸缓冲液洗3次后，按2 uL/孔用1%BSA封孔过夜。随后用含0.05% Tween-20的PBS（PBST）冲洗3～5次。按50 uL/孔加入VEGFR2单抗和VEGFR 2-ADM交联物，设置3个平行浓度，于37℃培养箱中孵育40 min。以PBST洗板5次，随后按50 uL/孔加入2500倍稀释后的辣根过氧化物酶标记的IgG抗体，于37℃培养箱中孵育40 min，96孔板再次用PBST冲洗6次。然后，按100 uL/孔加入1，2-苯二胺，室温黑暗下反应15 min。反应完成后，立即按100 uL/孔加入2 mol/L硫酸终止反应，酶标仪测定490 nm吸光值。

1.2.7 药代动力学实验 将SD大鼠，随机分成2组，每组10只。每组分别经尾静脉注射阿霉素纳米-VEGFR2交联物（交联物组，10 mg/kg体重）或游离阿霉素溶液（F-ADM组，10 mg/kg 体重）。分别在给药 0、0.25、0.5、1、2、4、6、8、24、48、96、144、192、240 h后剪尾采集 0.6 mL血液作样品，保存于肝素抗凝管，离心（3000 g×10 min），上清血浆保存于4℃冰箱中。向上清液中加入2 mL甲醇，充分摇匀后再次离心（5000 g×5 min）。采用HPLC法测定其中阿霉素浓度。数据采用3P 87软件进行模型拟合运算。

1.3 统计学方法 测定结果采用SPSS 11.0进行统计学分析，各组正态测量数据值均以“±s”表示。组间差异主要采用χ2检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ADM-NP的检测结果 扫描电镜下观察到制备的ADM-NP的表观形态如图1所示。结果显示ADM-NP呈球形结构，大小较均一，经检测ADM-NP的粒径为（160±34）nm。

图1 扫描电镜下的ADM-NP图Fig.1 ADM-NP chart under scanning electron microscopy

2.2 载药量和包封率 测定结果显示ADM-NP的载药量和包封率分别为（30.15±3.5）%和（80.56±4.24）%。

2.2 阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物免疫反应性 以ELISA方法测定结果见图2和3，阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物仍然能与IV型胶原酶以及表达IV型胶原酶的H 22细胞进行免疫结合，但其免疫结合能力与VEGFR2单抗相比，其结合抗原的能有所降低。

图2 阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物与IV型胶原酶的免疫反应性Fig.2 Immunoreactivity of Adriamycin Nanoparticles-VEGFR2 MAbs crosslinked product and Type IV collagenase

图3 阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物与H 22细胞的免疫反应性Fig.3 Immunoreactivity of Adriamycin Nanoparticles-VEGFR2 MAbs crosslinked product and H 22 cells

2.3 药代动力学药代动力学结果 如图4所示，在给药后F-ADM组药物浓度迅速下降。F-ADM组的ADM浓度在150 h后即测不出；而交联物组的ADM浓度下降缓慢，并且在2 h后ADM浓度一直高于F-ADM组，240 h时HPLC仍可测到血药浓度（0.323 mg/L）。结果表明，阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物在小鼠体内对ADM有良好的控制释放作用，可降低血药峰浓度，并能明显延长药物在血液中的保留时间。数据采用3P 87软件分析显示，其符合三室模型（见表1）。另外，在消除半衰期（t 1/2 β）、曲线下面积（AUC）、平均滞留时间（MRT）方面，交联物组明显大于F-ADM组（P＜0.01），表明阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物在体内有良好的缓释性。

图4 2组小鼠中阿霉素浓度随时间变化图Fig.4 Time change map of Adriamycin concentration in Mice

表1 阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物和F-ADM在小鼠体内的药代动力学参数（n=5）Tab.1 Pharmacokinetic parameters of Adriamycin Nanoparticles- VEGFR 2 MAbs crosslinked product and F-ADM in Mice(n=5)

3 讨论

载药纳米微粒是一种近年来研究较多的新型药物缓释体系。应用特定的包裹材料，采用纳米技术，可将某些药物，如化疗药物和抗生素等制备成纳米微粒。这种纳米微粒进入机体后，包裹在微粒中的药物可缓慢释放，起到缓释治疗效果。载药纳米微粒为延长化疗药物在体内的循环时间，增加药物对肿瘤组织的靶向性提供了一种可能，在药物输送方面具有许多优越性。

在纳米制备过程中我们所采用的初乳液乳化剂为Tween 80与Span 80的混合型乳化剂。Tween 80与Span 80的混合剂在油水界面上能够形成分子空间紧密排列的络合物，能够有效阻止乳液液滴的聚合，提高乳液稳定性，并且具有分离提纯方法十分简便的特点[8]。O-羧甲基壳聚糖作为复乳液乳化剂，兼具水溶性及乳化性能良好的优点，同时能起到修饰纳米微粒表面的作用。另外，它可连接其它靶向性物质，从而提高了纳米微粒的靶向性。

阿霉素是一种由肽链和发色团两个部分组成的抗肿瘤药、细胞毒类药物。其肽链部分本身没有细胞毒性，其作用是稳定发色团的结构和活性。根据这一特点，本研究以EDC作为交联剂，VEGFR2单抗与ADM-NP的表面的修饰物壳聚糖（O-CMC）相连接形成稳定的共价键，得到了以1∶1分子比连接产物为主的阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物，在进入细胞后经溶酶体降解释放出药物，易于发挥导向作用。

结果显示，阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物在和IV型胶原酶或H22细胞的结合能力上有所降低，但部分抗原结合活性仍然存留下来。以静脉给药的方式，HPLC法分析其药代动力学参数，阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物与F-ADM相比，阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物对ADM表现出良好的控释作用，能够有效降低血药峰浓度，并延长ADM在血液中的滞留时间。如后期研究能证明阿霉素纳米-VEGFR2单抗交联物能提高对肿瘤组织的靶向性，将具有比游离ADM更高的疗效，为其临床应用奠定了良好的基础。

[1] 李力军，高宏，封国生，等．放射性粒子125I与缓释化疗粒子联合应用靶向治疗复发性直肠癌[J]．中国实用外科杂志，2004，24（10）：612-613．

[2] Diane CD,Jacob TC,Matthew AB,et al．Vascular endothelial growth factor(VEGF) isoform regulation of early forebrain development[J]．Developmental Biology,2011,358：9-22．

[3] Xie Y,Fan JQ,Chen JH et al．A novel function for dendritic cell：Clearance of VEGF via VEGF receptor-1[J]．Biochemical and Biophysical Research Communicatio ns,2009,380：243-248．

[4] Lu D,Jimenez X,Zhang H,et al．Selection of high affinity human neutralizing antibodies to VEGFR 2 from a large antibody phage display library for antiangiogenesis therapy[J]．International Journal of Cancer,2002,97(3)：393-399．

[5] 戴丽娟，鄢成伟，李淑珍，等．抗VEGFR 2/抗CD3双特异单链抗体的表达及初步活性检测[J]．细胞与分子免疫学杂志，2011，27（8）：883-885．

[6] Stewart EA,Samaranayake GJ,Browning AC,et al．Comparison of choroidal and retinal endothelial cells：Characteristics and response to VEGF isoforms and anti-VEGF treatments[J]．Experimental Eye Research,2011,93：761-766．

[7] 伍星，王志刚，唐毅，等．携 VEGFR2单抗靶向微泡评价小鼠肿瘤新生血管[J]．中国医学影像技术，2009，25（6）：932-934．

[8] 殷香保，黎洪浩，陈汝福，等．聚乳酸阿霉素纳米微粒的制备及体内外释药的研究[J]．中华实验外科杂志，2006，23（2）：227-229．

[9] 刘志，严德辉，陈辉．NS-398 联合表阿霉素对肝癌 HepG 2 细胞增殖及survivin 表达的影响[J]．中国肿瘤，2012，21，（8）：619-623．

[10] 药晋鹏，戴立里，李娟，等．载阿霉素的液-固相变型原位凝胶注射治疗兔 VX2肝癌 HIFU消融后残癌[J]．中国介入影像与治疗学，2012，9（11）： 814-818．

[11] Menon SK,Mistry BR,Joshi KV,et al．Analytical detection and method development of anticancer drug Gemcitabine HCl using gold nanoparticles[J]．Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc,2012,10(94 C)：235-242

[12] 戚宁，杜明华．载阿霉素靶向制剂治疗肝癌研究现状[J]．医学综述，2012，18（11）： 1663-1665．

[13] 李宁，于力方，王珊，等．阿霉素纳米粒在肿瘤治疗中的应用研究[J]．现代生物医学进展，2012，12 （30）：5836-5837,5867．

[14] 张阳德，张峰，潘一峰，等．表阿霉素脂质体纳米粒治疗大鼠移植性肝癌的实验研究[J]．中国现代医学杂志，2011，21（25）：3078-3081．

[15] 刘奕明，林爱华，邓时贵，等．甘草酸表面修饰阿霉素壳聚糖纳米粒在小鼠体内的组织分布[J]．中国临床药理学与治疗学，2010，15（1）：66-71．

Preparation and pharmacokinetics study of immunoconjugate composed of Adriamycin nanoparticles and VEGFR2 monoclonal antibody

YIN Xiang-bao, WU Lin-quan, HUANG Ming-wen, LUO Zhi-qiang, YU Xin, HUANG Jun, XING Hong-song
(Department of General Surgery, The Second Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006,China)

ObjectiveTo prepare the immunoconjugate composed of Adriamycin nanoparticles and VEGFR 2 monoclonal antibody(conjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb) and study its pharmacokinetics property.MethodsAdriamycin nanoparticles were prepared by using double emulsion method, with PLA and O-CMC as materials. Conjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb was prepared by using molecule conjugate technology.Immunoreactivity of the conjugate with type IV collagenase and H22 cell were analyzed by using ELISA. Pharmacokinetics parameters of the immunoconjugate were obtained by using SD rats as study objects.ResultsThe prepared ADM-NP was sphere particles under SEM, which diameters were (160±34) nm. The drug loading rate and entrapment rate were (30.15±3.5)% and (80.56±4.24)% respectively. Conjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb was successfully prepared, which had immunoreactivity with type IV collagenase and H22 cell. The immunoconjugate showed good ADM control-release ability and could prolong the retention time of ADM in vivo.ConclusionConjugate of ADM-NP and VEGFR 2-MAb keeps the immunoreactivity of VEGFR 2-MAb and shows good ADM control-release ability.

VEGFR 2 monoclonal antibody; Adriamycin; nanoparticle

R 969．1

A

1005-1678(2014)02-0068-04

目前，化学治疗仍然是治疗肝癌，尤其是中晚期肝癌的重要手段。传统的全身化疗方法由于存在的众多缺点，化疗效果一直不尽人意。近年来，药物缓释治疗逐渐成为人们研究的热点。国内如李力军等[1]采用放射性125I粒子和5-FU缓释化疗粒子联合局部植入技术治疗复发性直肠癌，取得了满意效果。

近年来在许多恶性肿瘤组织中发现了血管内皮细胞生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF），它是一种高度特异的血管内皮细胞有丝分裂素，在肝癌组织中的阳性率较高[2]。VEGF能促进肿瘤血管的生成，进而促进肿瘤的生长[3]。血管内皮细胞生长因子受体2（vascular endothelial growth factor receptor-2，VEGFR2）是一种介导VEGF在肿瘤新生血管形成中发挥功能的主要受体，对肿瘤血管生成极其重要[4-5]。利用VEGFR2单抗与VEGFR2特异性受体结合的特性，可将某些治疗性成分如抗肿瘤药物或毒素等携带至肿瘤组织中，发挥免疫靶向治疗作用[6-7]。

江西省自然科学基金资助项目（2008 GQY 0050）；国家自然科学基金项资助项目（81060187）

殷香保，男，博士，副主任医师，研究方向：肝癌的综合治疗与防治，E-mail：zhoudinggeng@163.com。