补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞生长周期作用的影响

井欢，唐莹，于丹，刘春英 Δ

（1. 辽宁中医药大学 基础医学院 病理教研室,辽宁 沈阳 110032；2. 辽宁中医药大学 基础医学院 人体解剖教研室,辽宁 沈阳 110032）

补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞生长周期作用的影响

井欢1，唐莹2，于丹1，刘春英1Δ

（1. 辽宁中医药大学 基础医学院 病理教研室,辽宁 沈阳 110032；2. 辽宁中医药大学 基础医学院 人体解剖教研室,辽宁 沈阳 110032）

目的评估补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞生长周期的影响效果。方法体外培养人肺腺癌A549/DDP细胞，实验分组为：空白对照组，补中益气汤组和脾细胞处理组。用不同浓度的补中益气汤含药血清和脾细胞刺激A549/DDP细胞，采用MTT法（Methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）测定2种方法对细胞的直接杀伤作用；流式细胞术检测2种方法对细胞凋亡的影响；荧光显微镜观察2种方法对凋亡小体产生的影响。结果MTT法显示同空白对照组相比，补中益气汤含药血清对细胞生长均有抑制作用(P＜0．05)，且该法同脾细胞作用后效果类似；2种方法处理后，流式细胞术均可见特征性的细胞凋亡峰；在荧光显微镜下可见凋亡细胞。结论补中益气汤含药血清在体外能阻滞A 549/DDP细胞的生长增殖，诱导该细胞发生凋亡，且效果同脾细胞类似。

补中益气汤；A 549/DDP细胞；细胞周期；细胞凋亡

1.2 主要实验设备 低温超速离心机(OTD55B，DUPONT/SORVALL，美国)；流式细胞仪（FACScan， BECTON DICKINSON，美国）；Milli-Qsp REAGENT Water System（美国）；倒置显微镜（JMS，NIKON，日本）；流式细胞仪（FACScan，BECTON DICKINSON，美国）。

2 方法

2.1 A549/DDP细胞的体外培养与传代 每2～3 d更换一次培养基。肉眼观察培养液颜色，若由红色转为黄色，倒置显微镜观察细胞生长至70%～80%融合时，需要传代：弃去培养基，加0.25%Trypsin 500 uL，37℃消化3 min后，加5 mL培养基轻轻吹打瓶壁上的细胞使其均匀脱落，制成单细胞悬液。若发现细胞悬浮、碎裂或其他污染情况则及时丢弃。

2.2 含药血清的制备 将6只SD大鼠随机分为补中益气汤组和空白对照组，补中益气汤组大鼠给与补中益气汤11.34 g/kg体重，1日2次，空白对照组大鼠给与生理盐水11.34 g/kg体重，1日2次。连续给药处理后3 d，禁食12 h后，再次给药后麻醉，腹主动脉取血，分离血清后滤膜除菌，分装，置-20℃冰箱中保存备用。

2.3 脾细胞的制备 将1只SPF级BALB/c小鼠适应性喂养3 d后，取脾组织用PBS洗净，浸泡在含PBS的平皿中，用眼科剪尽可能剪碎组织，吸去上清液，组织块转移入大瓶中加入15 mL消化酶，37℃，30 min，并在磁力搅拌器上搅拌。在不锈钢网上轻轻研磨，滤液用300目沙网过滤3次，置于DMEM培养基中，37℃培养1h后进行试验。

2.4 MTT法检测对细胞直接杀伤作用 取对数生长期细胞用0.25% Trypsin消化成单细胞悬液，用完全培养基调整细胞浓度，96孔板分为 3个浓度组，（1×103/mL、1×104/mL、1×105/mL），每组3个平行孔，每孔接种100 μL细胞悬液，置5% CO2的37℃培养箱孵育细胞贴壁24 h。最终确定实验用细胞浓度为1×103/mL。将含药血清用孔径0.22 μm的一次性滤器除菌后，每孔中加10 μL溶液，终浓度为25 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL 及 200 μg/mL 4个梯度，设 3个复孔，对照孔中加等量空白血清。置于5% CO2的37℃培养箱孵育24 h。加入10 μLMTT溶液，充分混匀后置于5% CO2的37℃培养箱孵育4 h。加入100 μL异丙醇盐酸溶液，充分混匀后检测OD450值。取脾细胞悬液，加DMEM培养基及10%胎牛血清，稀释成1×103，再将其接种至96孔培养板中，每孔100 μL。培养72 h后加入细胞浓度为1×102的A549/DDP肺腺癌细胞，置含5%CO2的37℃培养箱孵育24 h后，每孔加10 μL MTT溶液，充分混匀后置于37℃，5% CO2孵箱中培养4 h。加人100 μL异丙醇盐酸溶液，充分混匀后检测OD450值。

2.5 流式细胞术检测细胞周期 取生长良好的A549/DDP细胞以1×103/mL接种于6孔细胞培养板上，对照组加入10%空白血清，稀释成1×103/mL，每孔100 μL，补中益气汤组加入同浓度同体积的补中益气汤含药血清；置37℃，5%CO2温箱培养24 h，用0.25%胰酶消化后，将细胞悬液加入离心管中，离心1000 r/min，5 min，去上清。取健康小鼠脾制成的脾细胞悬液，加DMEM培养基及10%胎牛血清，稀释成1×103/mL，接种至6孔培养板中，每孔100 μL。用PBS清洗2次，1000 r/min离心5 min，去上清。将70%乙醇缓慢滴入试管中，边滴边摇动试管，使细胞分散、固定，置4℃过夜备检。上述固定的A549/DDP细胞离心去上清，用PBS清洗2次，1000 r/min离心5min，调整细胞浓度为1×103/mL。取200 μL单细胞样品，加200 μL RNase溶液(10 μg/mL)，置37℃水浴摇床30 min。将细胞过滤去除聚积成团细胞，加250 μg/mL的碘化吡啶(PI)染液100 μL，置4℃，30 min，用FACScan流式细胞仪进行检测，结果采集用ModFit 3.0软件分析。

2.6 荧光显微镜观察凋亡小体 空白对照组加DMEM培养基及10%空白血清，稀释成1×103/mL，接种至96孔培养板中，每孔100 μL。补中益气汤组加DMEM培养基及10%补中益气汤含药清，稀释成1×103/mL，接种至96孔培养板中，每孔100 μL。脾细胞处理组用脾细胞悬液，加DMEM培养基及10%胎牛血清，稀释成1×103/mL，接种至96孔培养板中，每孔100 μL。取生长良好的A549/DDP细胞以1×103/mL，37℃共同培养48 h，离心弃上清液，细胞4℃固定5 min，用PBS冲洗3遍，加人20 μL PBS和4μL浓度为1 mmol/L的荧光色素Hoechst 33258，混匀后4℃染色10 min。蒸馏水洗片后，用滤纸吸去多余液体。封片剂封片后荧光显微镜下观察。

2.7 统计学方法 数据用EXCEL进行整理，采用SPSS 19.0进行统计分析，正态计量资料以“±s”表示，组间比较采用单因素方差分析，定义α=0.05，以P＜0.05为具有统计学意义。

3 结果

3.1 MTT法检测对细胞的杀伤作用 倒置显微镜下观察，对照组肿瘤细胞增生旺盛，补中益气汤组及脾细胞处理组细胞胞浆内出现大量空泡，培养液中出现部分悬浮细胞(见图1)。与空白对照组比较补中益气汤组和脾细胞处理组均有显著性抑制肿瘤细胞生长的作用（P＜0.05）。2种方法抑制作用无显著性差异（见表 1）。

图1 不同处理方法对A549/DDP细胞的杀伤作用Fig.1 Killing Effect of A549/DDP cell by different treatment methods

表1 补中益气汤及脾细胞对A549/DDP细胞生长抑制的影响Tab.1 The inhibition effect of A549/DDP cell by Buzhong Yiqi Decoction and spleen cells treatment respectively

3.2 流式细胞术检测细胞周期 与空白对照组比较，补中益气汤组和脾细胞处理组的样品中均可见特征性的细胞凋亡峰，空白对照组中未见凋亡峰（见图2）。

3.3 荧光染色检测细胞凋亡作用 与空白对照组比较补中益气汤组及脾细胞处理组荧光显微镜下均可见致密浓染的颗粒状或块状荧光的凋亡细胞，空白对照组中未见（见图3）。

图2 不同方法对A 549/DDP肺癌细胞凋亡的影响Fig.2 Apoptosis of A 549 lung cancer cells by different methods treatment

图3 不同方法对A549肺癌细胞凋亡小体的影响Fig.3 Effect of different methods on apoptotic bodies of A549 lung cancer cells by fluorescence microscopy

4 结论

随着细胞生物学及分子生物学的发展，人们认识到细胞周期的紊乱不仅会产生多种疾病，而且与肿瘤等疾病的发生均有密切关系[4-5]。80年代以来，西方科学家对中药研究产生了浓厚的兴趣；至今已相继报道了100多种具有免疫调节、抗肿瘤、抗病毒、抗感染、等多种生理活性的中药[6-8]；有的已在临床用于肿瘤、肝炎、心血管等疾病的辅助治疗和康复，其中最重要的药理作用当推免疫促进作用。已有的大量药理和临床应用表明，这些功能确切的物质，其原生药大多属于补益类中药[9-10]。补中益气汤作为补益剂的代表经典方之一，健脾益气，扶正祛邪，具有良好的临床实际效果，从而引起人们广泛的重视。由于化学成分、结构及作用机制不明，导致目前应用的中药制剂多为粗制剂，在分子水平上阐明药理作用的努力受到限制，因此加强这方面的研究非常必要[11-13]。研究证明：脾细胞对肿瘤细胞具有杀伤作用并能诱导凋亡[14-15]。本实验创新使用毒副作用小的补中益气汤为研究对象，从细胞周期角度进行研究，将结果同正常小鼠脾细胞作用后结果进行比较分析。实验结果表明：补中益气汤含药血清对体外培养的A549/DDP人肺腺癌肿瘤细胞具有抑制作用，该效果同脾细胞处理后效果类似。MTT显示出其具有抗肿瘤作用，流式细胞仪分析结果显示：补中益气汤含药血清可使肿瘤细胞增殖下降，细胞凋亡率增加，提示该方可能通过调节免疫功能来抑制肿瘤细胞增殖及促进细胞凋亡。免疫荧光亦提示：补中益气汤含药血清与脾细胞脾细胞均可诱导肿瘤细胞的凋亡，出现典型的凋亡形态学特征。综上所述，补中益气汤含药血清在体外能阻滞A549/DDP细胞的生长增殖，诱导该细胞发生凋亡，且效果同脾细胞类似，具体机制及相关信号传递过程需在今后的研究中深入探讨。

[1] Yamamoto M,Manabe S,Moriyama Y,et al．Long-term Remission Achieved via Combined Chemotherapy and Radio therapy in a Non-resectable Granulocyte Colony-stimulating Factor Producing Pleomorphic Carcinoma of the Lung[J]．Intern Med,2013,52(19)：2259-2263．

[2] Fang W,Tang S,Liu P,et al．Pd nanosheet-covered hollow mesoporous silica nanoparticles as a platform for the chemo-photothermal treatment of cancer cells[J]．Small,2012,8(24)：3816-3822．

[3] She EX,Hao Z．A novel piperazine derivative potently induces caspase-dependent apoptosis of cancer cells via inhibition of multiple cancer signaling pathways[J]．Am J Transl Res,2013,5(6)：622-633．

[4] Bradshaw NJ,Hennah W,Soares DC．NDE 1 and NDEL 1：twin neurodevelopmental proteins with similar‘nature' but different‘nurture'[J]．Biomol Concepts,2013,4(5)：447-464．

[5] Yu Q, GengY, Sicinski P．Specific protection against breast cancersby cyclinD 1 ablation[J]．Nature,2001,411(6841)：1017-1021．

[6] Wang X, Ren Z, He Y,et al．A combination of pharmacophore modeling,molecular docking and virtual screening for iNOS inhibitors from Chinese herbs[J]．Biomed Mater Eng,2013,23(10)：S 1367-S 1374．

[7] Bonggoo P,Yong ML,Jae SK,et al．Neutral sphingomyelinase 2 modulates cytotoxic effects of protopanaxadiol on different human cancer cells[J]．Complementary and Alternative Medicine,2013,13：194-205．

[8] Ricardo MY,Manoj M．Use of Traditional Chinese Medicine in the Management of Urinary Stone Disease[J]．Int Braz J Urol,2009,35(4)：396-405．

[9] Ma L,Jiao Z,Zhang R．Clinical observation on treatment of postcardiotomic complications with Chinese herbal medicine based on syndrome differentiation with angiocardiopathy[J]．Journal of integrated traditional Chinese and Western medicine China,1999,19(4)：206-208．

[10] 吴喜凤，韩淑英，朱丽莎，等．女贞子提取物对小鼠免疫功能的影响[J]．华北煤炭医学院学报，2008，10（3）：303-304．

[11] 金立弟，蔡卫家，刘丽．补中益气汤现代药效学研究[J]．吉林医学信息，2011，28（1）：41-42．

[12] Yang C,Wang J,Li D．Microextraction techniques for the determination of volatile and semivolatile organic compounds from plants：A review[J]．Anal Chim Acta,2013,799(13)：8-22．

[13] Xia ZS,He FY,Deng KW,et al．Special influence of molecular imprinting technology on traditional Chinese medicine theories[J]．China Journal of Chinese Materia Medica,2013,38(8)：1266-1270．

[14] 雷萍，陈文娜，陈殿学，等．灰树花提取物对脾虚小鼠腹腔巨噬细胞和脾细胞的影响[J]．中国实验方剂学杂志，2011,17（10）：205-207．

[15] 董志恒，曲萌．IL-2联合银耳多糖激活的脾细胞对体外肿瘤细胞杀伤作用的研究[J]．北华大学学报(自然科学版)，2004，5（6）：506-508．

Effect of Buzhong Yiqi Decoction serum on cell cycle of A 549/DDP cell

JING Huan1,TANG Ying2,YU Dan1, LIU Chun-ying1Δ

(1.Department of Pathology, College of Basic Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032,China;2.Department of Human Anatomy, College of Basic Medicine，Liaoning University of Traditional Chinese Medicine, Shenyang 110032 ,China)

ObjectiveTo study the effect of Buzhong Yiqi Decoction serum on cell cycle of A549/DDP cell.MethodsA549/DDP cells and splenocytes cells were cultured in vitro and divided randomly into three groups: control group, Buzhong Yiqi Decoction group and splenocyte group.A 549/DDP cells were stimulated by different concentrations of Buzhong Yiqi Decoction serum and spleen cells, the direct killing effect on cells were measured by MTT method, cell apoptosis were detected by flow cytometric analysis and the apoptotic body were observed by immunofluorescence method.ResultsMTT results showed that cell growth were inhibited by Buzhong Yiqi Decoction serum in contrast with control groups, and the effect was same as spleen cells, and both treated groups had similar effects. Marked apoptotic peak and the apoptotic body were seen by flow cytometric analysis and fluorescence microscope in both two groups.ConclusionBuzhong Yiqi Decoction could inhibit the proliferation of A549/DDP cells in vitro and induced cell apoptosis, which is the similar as spleen cells.

Buzhong Yiqi Decoction;A549/DDP cell;cell cycle;apoptosis

R 734．2

A

1005-1678(2014)02-0048-03

据WHO统计，目前全世界肺癌的发病率和死亡率呈逐年上升趋势[1]，严重影响人类健康。应用化学药物治疗虽是临床主要方法，但随之而来的不良反应（如头晕、呕吐、厌食、无力等），常导致化疗失败[2]。补中益气汤出自金代名医李东垣《脾胃论》，为经典复方。由于肺癌细胞对凋亡信号的调控不敏感，导致生存期延长，凋亡速度低于增殖速度[3]，从而导致疾病向恶性情况发展。本实验主要观察补中益气汤含药血清对A549/DDP细胞的增殖及凋亡影响，并采用脾细胞作为阳性对照因素，旨在研究该复方抗肿瘤的机制，现报道如下。

1 材料

1.1 主要材料 A549/DDP细胞株均购自中国医学院肿瘤研究中心；胎牛血清、胰蛋白酶消化液、DMEM培养基及多聚赖氨酸均购自武汉博士德生物工程有限公司；补中益气汤药材购自辽宁中医药大学附属医学院；SD大鼠(体重180～200 g)、SPF级BALB/c小鼠(体重10～12 g)，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：scxk(京)2011-0011。

辽宁省自然基金资助项目（20102145）

井欢，女，副教授，硕士生导师，研究方向：中药免疫调节与中药抗肿瘤，E-mail：2974907780@qq.com;刘春英，通信作者，女，教授，博士生导师，研究方向：中药抗肿瘤作用机制研究，E-mail：chunying 99@163.com。