海藻玉壶汤对甲状腺癌荷瘤小鼠趋化因子受体CXCR4的影响研究

张勤良，关琪

（1.沈阳医学院附属中心医院 肛肠科，辽宁 沈阳 110024；2.沈阳医学院附属中心医院 检验科，辽宁 沈阳 110024）

海藻玉壶汤对甲状腺癌荷瘤小鼠趋化因子受体CXCR4的影响研究

张勤良1，关琪2Δ

（1.沈阳医学院附属中心医院 肛肠科，辽宁 沈阳 110024；2.沈阳医学院附属中心医院 检验科，辽宁 沈阳 110024）

目的研究海藻玉壶汤对荷瘤小鼠实体瘤中趋化因子受体CXCR4表达的影响。方法体外培养人甲状腺癌TT细胞，接种健康BALB/c小鼠30只，荷瘤成功后给予海藻玉壶汤治疗，实验分组为：荷瘤对照组（n=10），海藻玉壶汤高剂量组（n=10）及海藻玉壶汤低剂量组（n=10），观察小鼠肿瘤生长情况计算抑瘤率。取实体瘤后，免疫组化法检测趋化因子受体CXCR4的表达，利用实时定量PCR（real time polymerase chain reaction，RT-PCR）检测CXCR 4 mRNA的表达。结果同荷瘤对照组相比，海藻玉壶汤高低剂量组在蛋白和基因层次上降低了趋化因子受体CXCR4的表达，该影响对浓度呈一定的依赖性。结论海藻玉壶汤可降低趋化因子受体CXCR4的表达。

海藻玉壶汤；CXCR 4；人甲状腺癌细胞；BALB/c小鼠

1.2 方法

1.2.1 海藻玉壶汤煎剂的制备 根据2010年《中华人民共和国药典》中规定海藻玉壶汤的用药剂量，海藻30 g，昆布15 g，贝母15 g，法半夏10 g，独活10 g，青皮5 g，陈皮10 g，当归10 g，川芎10 g，连翘10 g，甘草10 g，海带5 g配伍后加10倍水浸泡过夜，按照生药5.82 g/kg（高剂量）、生药1.46 g/kg（低剂量）煎煮3次，每次30 min，过滤，浓缩至每1 mL含生药1 g的水煮液，置4℃冰箱保存备用。

1.2.2 动物分组与处理 BALB/c小鼠30只，按照随机数字表分成3组，实验分组为：荷瘤对照组（n=10），海藻玉壶汤低剂量组（n=10）及海藻玉壶汤高剂量组（n=10），小鼠均于背部注射甲状腺癌TT细胞悬液0.1 mL（约2×106个），4 w后成瘤开始用药。荷瘤对照组予生理盐水灌胃，0.5 mL/只，日2次；海藻玉壶汤低剂量组予低剂量海藻玉壶汤灌胃，0.5 mL/只，日2次；海藻玉壶汤高剂量组予高剂量海藻玉壶汤灌胃，0.5 mL/只，日2次。小鼠成瘤后，1周2次观察接种肿瘤的生长并用游标卡尺测量肿瘤结节的最长径a和最短径b，根据公式计算肿瘤体积：V(mm 3)=1/6 π(ab2)。用药3周后，处死小鼠，剥离实体瘤，称量湿重，根据公式计算抑瘤率：肿瘤抑瘤率（%）=[1-（平均实验组瘤重/平均对照组瘤重）]×100%。

1.2.3 免疫组织化学法检测CXCR4蛋白表达 将造模后BALB/c小鼠的瘤组织，经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，连续切片，片厚5μm。切片脱蜡至水。滴加5%BSA封闭液，室温10 min。甩去多余液体，不洗。滴加兔抗鼠CXCR4抗体，4℃冰箱中过夜，PBS（pH 7.2～pH 7.6）洗 2 min×3 次。滴加生物素化山羊抗兔IgG，37℃ 20 min。PBS洗2 min×3次。滴加试剂SABC，20℃～37℃20 min。PBS洗5 min×4次。DAB显色，光镜下控制反应时间，蒸馏水洗涤。苏木素轻度复染。显微镜下拍照观察。用Quantity One图像分析软件进行分析，以细胞浆/膜或核中出现粗细一致的棕黄色颗粒作为阳性，随机取5个视野，在400倍高倍镜下，计数细胞，测出阳性反应细胞的总面积和积分光密度，求出平均光密度。

1.2.4 RT-PCR检测mRNA表达 取冷冻保存的实体瘤组织 0.1～0.2 g，采用 Tr i z o l法提取组织RNA，按照说明书步骤进行。CXCR4引物序列：上游引物 5'-GGAGGGGATCAGTATATACA-3'，下游引物5'-GAAGATGGAGTAGATGG-3'，145 bp；内参序列：上游引物5'-GAAGGTCAAGGTCGGAGTC-3'，下游引物5'-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3'，226 bp；25 μL 反应体系，预变性94℃1 min，退火60℃1 min，延伸72℃2 min，循环35次。余按试剂盒说明进行操作，用反应产物的吸光度与内参的比值表示该基因表达强度。

1.3 统计学方法 用SPSS 19.0统计学软件进行数据分析，正态计量资料用“±s”表示，组间比较用采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 海藻玉壶汤对小鼠肿瘤的影响 与同期未治疗的荷瘤对照组小鼠比较，经海藻玉壶汤治疗后的小鼠出现肿瘤生长减缓现象（见图1）。取材后称取瘤重可知，荷瘤对照组小鼠瘤重为（2.16±0.78）g，海藻玉壶汤高剂量组小鼠瘤重为（1.49±0.56）g，抑瘤率为31.0%；海藻玉壶汤低剂量组小鼠瘤重为（1.26±0.77）g，抑瘤率为 41.7%。

图1 不同组别肿瘤的体积Fig.1 Tumor volume of different groups

2.2 免疫组织化学法检测CXCR4表达 荷瘤对照组CXCR4蛋白表达较多，呈深棕色。海藻玉壶汤高低剂量组肿瘤细胞胞膜及胞浆上CXCR4蛋白表达较少。通过计算AOD值可知，海藻玉壶汤低剂量组和海藻玉壶汤高剂量组同荷瘤对照组相比，CXCR4蛋白表达均显著降低（P＜0.05），海藻玉壶汤高剂量组同海藻玉壶汤低剂量组相比，CXCR4蛋白表达显著降低（P＜0.05，见图 2、表 1）。

图2 不同组CXCR4蛋白的表达（×400）Fig.2 The expression of different groups of CXCR 4 protein(×400)

表1 CXCR4蛋白表达的AOD值Tab.1 AOD for CXCR 4 expression

2.3 RT-PCR检测CXCR4 mRNA的表达 采用RTPCR方法检测CXCR4 mRNA表达，海藻玉壶汤高、低剂量组mRNA同荷瘤对照组相比，表达均显著降低（P＜0.05），但海藻玉壶汤高低剂量组之间无显著差异（见图3）。

Fig.3 mRNA expression of CXCR 4 detected by RT-PCR*P＜0.05， compared with tumor-bearing mice control group

3 讨论

趋化因子由一系列分子量为8～12 kDa的分泌型小分子多肽组成的家族[4-6]，由1992年第二届关于趋化作用细胞因子讨论大会上命名，属跨膜G蛋白偶联受体超家族，参与多种生理和病理过程。趋化因子受体CXCR4在恶性肿瘤的浸润转移中有重要作用，与恶性肿瘤的发生、侵袭、转移关系密切[7-9]。祖国传统医学中，无甲状腺癌一类名词，辩证当属“瘿瘤”。《外科正宗 瘿瘤论》云：“夫人生瘿瘤之症，非阴阳正气结肿，乃五脏瘀血、浊气、痰滞而成”[10-11]。《外科大成》亦云：“夫瘿瘤者，由五脏邪火浊气，瘀血痰滞，各有所感而成。”对其治疗，提出了经典方药海藻玉壶汤[12-13]。大量实践也表明类似海藻玉壶汤以益气养血、软坚散结兼活血化瘀的中药对甲状腺癌患者，在临床症状方面具有一定效果，同时可以降低血清甲状腺球蛋白水平[14-15]，本实验主要建立甲状腺癌TT细胞裸鼠模型，探究该经典复方对甲状腺癌疗效的影响，为研究作用机理提供实验依据。由结果可以看出，海藻玉壶汤能够使小鼠出现肿瘤生长减缓现象，并且降低趋化因子受体CXCR4的表达。其中蛋白水平上，海藻玉壶汤高剂量组效果优于海藻玉壶汤低剂量组（P＜0.05），而基因水平上二者相差不大。这说明，海藻玉壶汤对甲状腺癌的抑制作用，这与王业生[16]等人研究结论一致，可能与改变趋化因子受体CXCR4的表达有关，具体机制有待进一步研究。

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Effects of Haizao Yuhu Decoction on chemokine receptor CXCR4 in TT cell tumor-bearing mice

ZHANG Qin-liang1, GUAN Qi2Δ
(1.Department of Anorectal Disease, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024 China;2.Department of Medical Laboratory, Central Hospital Affiliated to Shenyang Medical College, Shenyang 110024, China)

ObjectiveTo observe the effects of Haizao Yuhu Decoction on the CXCR 4 expression of TT cell tumor-bearing mice.MethodsCulture the human thyroid TT cells in vitro, and inoculate them into 30 healthy mice BALB/C. Subsequently, Haizao Yuhu Decoction was given to the tumor-bearing mice. They are grouped into three groups, including tumor-bearing group (n=10), Haizao Yuhu Decoction high dosage group(n=10) and Haizao Yuhu Decoction low dosage group (n=10) to observe the tumor growth to calculate the anti-tumor rate. After the tumor has been reaped, immunohistochemical is adopted to test the expressions of chemotactic factor receptor—CXCR 4 on protein level. RT-PCR is used to test the expressions of CXCR 4 on genetic level.ResultsComparing with the tumor-bearing group, HZYHD high-dosage group has decreased the expressions of CXCR 4 on both the protein and genetic levels, which is to certain degree dependent on concentration.ConclusionHaizao Yuhu Decoction could decrease the expression of CXCR 4.

HaizaoYuhu Decoction;CXCR 4;TT cell;BALB/c mice

R 453．9

A

1005-1678(2014)02-0042-03

海藻玉壶汤出自《外科正宗》，由海藻、贝母、陈皮、青皮、昆布等12味中药组成，是传统治疗瘿病之方，广泛应用于以瘰疬为主要临床特征的疾病[1-2]。趋化因子（chemoattractant cytokines，CK）是指机体内一群能使细胞发生趋化运动的小分子细胞因子，在抗感染和免疫中起关键性作用。已有研究证明[3]，趋化因子的家族成员CXCR4，同在多种恶性肿瘤中表达相关，特别是在甲状腺癌中有很高的强阳性表达率，随着病理分化程度的降低，强阳性的表达率逐渐升高。本实验通过建立甲状腺癌TT细胞荷瘤小鼠模型，通过不同浓度海藻玉壶汤对其进行处理，观察小鼠肿瘤生长情况，计算抑瘤率，并通过生物学实验方法检测实体瘤上趋化因子CXCR4表达情况，探究该经典复方对甲状腺癌疗效的影响，为研究该方药的作用机理提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 主要材料与试剂 甲状腺癌TT细胞株购自中国医学院肿瘤研究中心（北京）；SPF级BALB/c小鼠30只，雌雄各半购于北京维通利华实验动物技术有限公司，许可证编号：scxk（京）2011-0011；胎牛血清购于Hyclone（货号：SH 30084.03）；DMEM培养基购于北京鼎国（货号：CC 0031）；RIPA裂解液购于北京鼎国（货号：WB-0071）；海藻玉壶汤材购自北京同仁堂药店；荧光定量PCR仪购于ABI公司（9700型）。

辽宁省自然科学基金（201102150）

张勤良，男，硕士，副主任医师，研究方向：中西医结合治疗肛门结肠病基础和临床，E-mail：zql_1681@163.com；关琪，通信作者，男，博士，主任检验师，研究方向：抗肿瘤及抗病毒免疫，E-mail：guanqi 1231@sina.com。