虫草菌液对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的影响

刘彤崴，周盾，郝春艳

（辽宁医学院附属第一医院 肾病内科，辽宁 锦州 121001）

虫草菌液对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的影响

刘彤崴，周盾，郝春艳

（辽宁医学院附属第一医院 肾病内科，辽宁 锦州 121001）

目的探讨虫草菌液对糖尿病肾病肾小管上皮细胞转分化的影响。方法将不同浓度的虫草菌液和高糖作用于人近端肾小管上皮细胞，根据加入剂量和组份不同分成以下5组：对照组给予5.5mmol／L D-葡萄糖；高糖组给予30mmol／L D-葡萄糖；实验组1给予30mmol／L D-葡萄糖 ＋5μg／mL虫草菌液；实验组 2给予 30 mmol／L D-葡萄糖 ＋10μg／mL虫草菌液；实验组 3给予30mmol／L D-葡萄糖 ＋20μg／mL虫草菌液。检测各组细胞内E-钙粘蛋白（E-Cadherin），纤连蛋白（fibrous protein，FN），α-平滑肌肌动蛋白（a-smooth muscle actin，α-SMA）及整合素连接激酶（Integrin Linked Kinase，ILK）蛋白的表达。结果与对照组相比，高糖组E-cadherin蛋白表达显著降低（P＜0.01），且随着虫草菌液加入的量升高，E-cadherin蛋白表达也逐渐升高（均P＜0.01）。与对照组相比，高糖组α-SMA蛋白和FN蛋白表达均显著升高（P＜0.01），且2蛋白在实验组2和实验组3中表达均较高糖组显著下降（均P＜0.01）。与对照组相比，高糖组ILK蛋白表达显著升高（P＜0.01），实验组3 ILK蛋白表达较高糖组显著下降（P＜0.01）。结论虫草菌液能够抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化，从而抑制肾小管间质纤维化。

虫草菌液；糖尿病肾病；肾小管上皮细胞

1 材料与方法

1.1 主要材料、试剂与仪器 试验细胞为人肾小管上皮细胞（中美合资博慧斯生物医药科技有限公司）。主要仪器：CO2恒温培养箱（BOI-50，上海三腾仪器有限公司），96孔细胞培养板（北京萌壮科技），低速离心机（JK-CTL-TD5A，上海精学科学仪器有限公司），微量离心机（Mini-6K，北京博瑞祥腾科技有限公司），酶标分析仪（DNM-9602型，北京普朗），恒温水浴槽（5000-V20-HT90，杭州仪华仪器）。主要试剂：胎牛血清（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司），胰蛋白酶（北京格源天润生物技术有限公司）；D-葡萄糖（云南白药，国药准字 H53021483），D-甘露醇（广州远东药业，国药准字H44022709），虫草菌液（杭州中美华东制药有限公司，国药准字Z10910037），小鼠GAPDH单克隆抗体（艾美捷科有限公司），小鼠抗人纤维连结蛋白单克隆抗体（艾美捷科有限公司），小鼠抗人E-Cadherin单克隆抗体（艾美捷科有限公司），兔抗人整合素连接激酶多克隆抗体（艾美捷科有限公司）。

1.2 研究方法

1.2.1 细胞培养及传代：人肾小管上皮细胞采用含10%FBS低糖DMEM培养基培养，37℃，5%CO2，每2～3 d换液1次。镜下观察细胞融合度达80～90%时，用0.2%的胰蛋白酶溶液消化传代。细胞传代：弃去培养瓶中的培养液，加D-Hanks液2mL，晃动冲洗瓶底，洗去残留的胎牛血清；弃去D-Hanks液，加入0.2%的胰蛋白酶进行消化，将消化后的细胞分别装入2个培养瓶，加入新培养基，37℃，5%CO2条件下进行培养。

1.2.2 药物处理和分组：选择虫草菌液的剂量为分别为5、10、20μg／mL。根据加入剂量不同分成以下 5组：对照组含5.5mmol／L D-葡萄糖，高糖组含 30 mmol／L D-葡萄糖，实验组 1含 30 mmol／L D-葡萄糖和 5μg／mL虫草菌液，实验组 2含30mmol／L D-葡萄糖和 10μg／mL虫草菌液，实验组 3含30mmol／L D-葡萄糖和20μg／mL虫草菌液。

1.3 Western Blot检测 药物作用48 h后收集细胞，提取细胞总蛋白。吸干培养液，加入4℃存放的PBS液3 mL洗涤3次，加400μL PMSF裂解液，12 000 r／min离心 15min，去上清用于蛋白含量测定，蛋白含量测定方法Bio-Rad DC protein assay。采用Western Blot检测细胞 E-Cadherin、FN、α-SMA及ILK蛋白表达情况，采用Bio Rad quantity one软件分析信号强度，蛋白相对表达量＝目的蛋白灰度值／内参照灰度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS15.0进行数据处理，正态计量资料用“±s”表示，采用F检验和t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组肾小管上皮细胞E-cadherin蛋白表达情况 与对照组相比，高糖组E-cadherin蛋白表达显著降低（P＜0.01），且随着加入虫草菌液的量升高，E-cadherin蛋白表达也逐渐升高（见表1、图1）。

表1 各组E-cadherin蛋白表达情况Tab.1 E-cadherin expression in all groups

图1 各组E-cadherin蛋白表达结果1.对照组；2.高糖组；3.实验组1；4.实验组2；5.实验组3Fig.1 Expression of E-cadherin pritein in each group1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

2.2 各组α-SMA蛋白表达情况 高糖组α-SMA蛋白表达显著升高，虫草菌液的量为10μg／mL和20μg／mL组α-SMA蛋白表达较高糖组显著下降（P＜0.01，见表2）。

表2 各组α-SMA蛋白表达情况Tab.2 α-SMA expression of all groups

图2 各组α-SMA蛋白表达western blot结果1.对照组；2.高糖组；3.实验组1；4.实验组2；5.实验组3Fig.2 Western blot results ofα-SMA expression of all groups1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

2.3 各组FN蛋白的表达 高糖组FN蛋白表达显著升高，虫草菌液的量为10μg／mL和20μg／mL组FN蛋白表达较高糖组显著下降（P均＜0.01，见表3）。

表3 各组FN蛋白的表达Tab.3 FN expression of all groups

2.4 各组ILK蛋白表达情况 高糖组ILK蛋白表达显著升高，虫草菌液的量为20μg／mL组ILK蛋白表达较高糖组显著下降（P＜0.01，见表4）。

图3 各组FN蛋白表达蛋白表达western blot结果1.对照组；2.高糖组；3.实验组1；4.实验组2；5.实验组3Fig.3 Western blot results of FN expression in all groups1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

表4 各组ILK蛋白表达情况Tab.4 ILK expression in all groups

图4 各组ILK蛋白表达蛋白表达western blot结果1.对照组；2.高糖组；3.实验组1；4.实验组2；5.实验组3Fig.4 Western blot Results of ILK expression of all groups1.Control group；2.High glucose group；3.Experimental group 1；4.Experimental group 2；5.Experimental group 3

3 讨论

糖尿病肾病是糖尿病患者重要的合并症，在我国糖尿病肾病的发病率呈上升趋势，已经成为终末期肾脏病的第二位原因，仅次于肾小球肾炎。因糖尿病肾病存在复杂的代谢紊乱，一旦发展为终末期肾病，比其他肾脏疾病的治疗更棘手，因此防治的意义更加重要。糖尿病肾病的发病机制主要是高血糖导致肾脏血流动力学发生改变以及糖代谢异常，从而导致肾脏损伤。肾组织局部的糖代谢紊乱，通过非酶糖基化形成糖基化终末代谢产物，激活多元醇通路，进一步激活二酰基甘油-蛋白激酶C途径，导致已糖胺通路代谢异常。这些改变参与了早期的高滤过，促进肾小球基底膜增厚和细胞外基质蓄积。细胞外基质的蓄积导致肾间质纤维化，包括Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型胶原纤维，FN（纤维连接蛋白），层粘连蛋白及骨桥素等。细胞外基质主要由肌成纤维细胞产生，在病理情况下，间质成纤维细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞、循环中的单核细胞以及肾小管上皮细胞等均可被激活而转化为肌成纤维细胞［5-6］。

冬虫夏草是一种传统的药材，冬虫夏草中82.2%为不饱和脂肪酸，此外，尚含有维生素B12、麦角脂醇、六碳糖醇、多种生物碱等，主要活性成分是虫草素，具有调节免疫功能、抗肿瘤、抗疲劳等效果，虫草素对小鼠肿瘤细胞的增殖具有强抑制作用，其渗入到RNA中，在细胞内磷酸化为3'-ATP，导致mRNA吸收和成熟障碍，而达到抑制肿瘤的作用［7-8］。现代医学临床研究表明，冬虫夏草吞噬肿瘤细胞的能力是硒的4倍，冬虫夏草所含虫草素能明显增强红细胞粘附肿瘤细胞的能力，抑制肿瘤生长和转移；能明显提升白血球和血小板数量，迅速改善放化疗后的呕吐恶心、胃口差、头发脱落、失眠等症状［9］。研究显示冬虫夏草能够抑制糖尿病肾病大鼠肾脏纤维化过程［10］。

钙粘素（cadherin）属亲同性CAM，其作用依赖于Ca2＋。至今已鉴定出30种以上钙粘素，分布于不同的组织。E-钙粘素主要集中在着床前的胚胎、上皮细胞（在带状粘合处特别集中）［11］。因此本研究通过测定肾小管上皮细胞E-钙粘素情况来判断细胞向肌成纤维细胞的转化情况。结果显示高血糖素肾小管上皮细胞E-钙粘素的表达显著下降（P＜0.01），说明具有肾小管上皮细胞特征的细胞显著下降。而加入虫草菌液后，E-钙粘素的表达较高糖组有所升高，并且随着加入量的增加，升高程度也越来越高。α平滑肌肌动蛋白（α-SMA）是肌成纤维细胞的标志蛋白之一［12］。在本次实验中，高糖组α-SMA的表达显著升高，提示高血糖能够诱导肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化。而随着加入的虫草菌液量的增加，α-SMA显著下降（P＜0.01）。研究显示，在健康人的肾脏间质中未发现表达α-SMA的肌成纤维细胞，而糖尿病肾病患者肾小管间质区域α-SMA表达增加。纤维连接蛋白（fibronectin，FN）是1974年国外开始研究发现的一种高分子糖蛋白，具有多种生物学功能，是肾间质纤维化的主要成分之一［13］。在本次实验中，与对照组比较，高糖组细胞中FN蛋白的表达显著升高。但是加入虫草菌液后，FN蛋白的表达有所下降，尤其是浓度为10μg／mL和20μg／mL组（实验组2和实验组3），与高糖组比较，有显著下降。整合素连接激酶（ILK）是一种新发现的Ser／Thr（丝氨酸／苏氨酸）蛋白激酶，通过与整合素β1亚单位结合从而介导细胞与胞外基质的连接，以依赖于PI3K的方式激活，并通过磷酸化下游底物PKB／AKT、GSK3等使胞外信号得以向下游传递，对细胞的生长、分化、迁移等进行调控［14］。ILK具有多种蛋白激酶活性，参与细胞粘附、基因表达、细胞外基质沉积等过程。研究显示其参与了TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞转化过程中的多个关键步骤，是关键调节因子之一［15］。在本次实验中，高糖组ILK蛋白表达显著升高，而加入虫草菌液后，其表达有所下降，尤其是20 μg／mL组（实验组3）较高糖组显著下降。

综上所述，虫草菌液能够增加高糖作用下肾小管上皮细胞E-钙粘素的表达，降低其α-SMA、FN、ILK的表达，提示其具有抑制肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的转化，从而抑制肾小管间质纤维化的过程。

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（编校：吴茜）

Effect of Cordyceps sinensis liquid on diabetic nephropathy renal tubular epithelial cell transdifferentiation

LIU Tong-wei，ZHOU Dun，HAO Chun-yan

（Department of Nephrology，The First Affiliated Hospital of Liaoning Medical Colleage，Jingzhou 121001，China）

ObjectiveTo discuss the effect of Cordyceps sinensis liquid on Diabetic Nephropathy renal tubular epithelial cell transdifferentiation.MethodsDiabetic Nephropathy renal tubular epithelial cells were treated with different dose of Cordyceps sinensis liquid and high glucose，and divided into five groups.Control group was added 5.5 mmol／L D-glucose，High glucose group was added 30 mmol／L D-glucose，Experimental group 1 was added 30mmol／L D-glucose and 5μg／mL Cordyceps sinensis liquid，Experimental group 2 was added 30 mmol／L D-glucose and 10μg／mL Cordyceps sinensis liquid，Experimental group 3 was added 30 mmol／L D-glucose and 20μg／mL Cordyceps sinensis liquid.The expression of E-cadherin protein，FN protein，α-SMA protein and ILK protein in each group were detected by western blot.ResultsCompared with control group，the expression of E-cadherin protein in high glucose was decreased significantly（P＜0.01），and with the addition of Cordyceps bacteria increases，E-cadherin protein expression in three Experimentgroup were gradually increased（P＜0.01）.Compared with control group，the expression of α-SMA protein and FN protein in High glucose group were increased significantly（P＜0.01），and both two protein in Experiment group 2 and Experiment3 were significantly lower than High glucose group（P＜0.01）.Compared with control group，the expression of ILK protein in high glucose group was significantly higher（P＜0.01），and its expression in Experiment group 3 was significantly lower than High glucose group（P＜0.01）.ConclusionCordyceps sinensis liquid can inhibit diabetic nephropathy renal tubular epithelial cell translating into myofibroblast，then inhibit renal tubule interstitial fibrosis.

Cordyceps sinensis liquid；diabetic nephropathy；renal tubular epithelial cell

R285.5

A

1005－1678（2014）04－0047－04

糖尿病肾病是2型糖尿病常见的合并症，随着糖尿病发病率的上升，其发生率也呈上升趋势，且成为终末期肾病的主要原因。肾小管间质病变是糖尿病肾病的重要病理改变，表现为细胞外基质在肾间质的过量堆积［1-2］。病理情况下肾小管上皮细胞能够转化为肌成纤维细胞，而肌成纤维细胞是产生细胞外基质的主要细胞［3-4］。本研究通过将高糖及不同浓度的虫草菌液作用于体外培养的人近端肾小管上皮细胞，测定上皮细胞表型特征、肌成纤维细胞表型特征等蛋白，旨在观察虫草菌液在肾小管上皮细胞-肌成纤维细胞转分化过程中的作用。

辽宁省科技厅课题（201101575）

刘彤崴，女，本科，中级，研究方向：肾病内科，E-mail：2912878480＠qq.com。