蒽贝素联合阿霉素对乳腺癌细胞MCF-7增殖和荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响

李宗祥，孙平

（华中农业大学医院，湖北 武汉 430070）

蒽贝素联合阿霉素对乳腺癌细胞MCF-7增殖和荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响

李宗祥，孙平Δ

（华中农业大学医院，湖北 武汉 430070）

目的探讨阿霉素（doxorubicin，DOX）联合X连锁凋亡抑制蛋白小分子抑制剂蒽贝素（embelin，EB）对乳腺癌细胞MCF-7增殖及荷瘤裸鼠肿瘤生长的影响。方法根据加入药物的不同将MCF-7细胞分为生理盐水组、阿霉素干预组、蒽贝素干预组和联合干预组（蒽贝素＋阿霉素）。MTT法检测各组对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响。流式细胞术检测各组肿瘤细胞凋亡情况。构建乳腺癌MCF-7细胞肿瘤球模型，探讨阿霉素联合蒽贝素对肿瘤球的生长抑制作用。建立乳腺癌裸鼠移植瘤模型，探讨阿霉素联合蒽贝素对乳腺癌异位瘤的生长抑制作用。结果乳腺癌MCF-7细胞在给药后48h，联合干预组对肿瘤细胞的增殖抑制率显著大于其他给药组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；细胞凋亡实验和肿瘤球生长抑制实验都表明联合干预组的肿瘤细胞抑制能力显著强于其他组，差异具有统计学意义（P＜0.01）；荷瘤小鼠实验结果显示，联合干预组的肿瘤生长抑制作用显著强于其他组，差异具有统计学意义（P＜0.01）。结论阿霉素与蒽贝素均具有抑制乳腺癌增殖的作用，2者联合应用能够发挥协同作用，增强抗肿瘤能力。

阿霉素；蒽贝素；乳腺癌

1 材料与方法

1.1 材料 DMEM高糖培养基和胎牛血清（美国GIBCO公司）；阿霉素（浙江海正药业，批号：14202）；蒽贝素（美国 sigma公司）；其余试剂为分析纯。人源乳腺癌细胞（MCF-7，ATCC）。雌性裸鼠（20～30 g，购自武汉大学实验动物中心，合格证号：WHDX20102372）。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌MCF-7细胞的培养：将MCF-7细胞置于含有100mg／L胎牛血清的DMEM培养基中培养，培养条件为5%CO2，饱和湿度，温度为37℃。待细胞汇合度为0.8～0.9时，用2.5mg／L胰蛋白酶消化传代，取增殖期细胞进行实验。

1.2.2 MTT检测不同药物对肿瘤细胞的增殖抑制作用：将MCF-7细胞分为生理盐水组、阿霉素干预组、蒽贝素干预组和联合干预组（蒽贝素＋阿霉素）。培养MCF-7细胞，接种于96孔板中，当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时分别加入无菌过滤后的蒽贝素溶液（40mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽贝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15 mmol／mL）溶液。将孔板移入37℃5%CO2孵箱中继续培养24 h和48 h后取出，每孔加入20μL 5 g／LMTT溶液，再放回孵箱中继续孵育4 h。将孔板中液体倒出，每孔加入200μL DMSO，37℃避光振摇15min，用酶标仪在490 nm处测定各孔的吸光度值（A）。

1.2.3 细胞凋亡检测：按“1.2.2”方法培养细胞并分组，给药后将MCF-7细胞继续培24 h，用冰PBS清洗细胞3次，FITC／PI双染，细胞避光放置15 min，采用流式细胞仪检测细胞凋亡数量。

1.2.4 肿瘤球生长变化检测：取对数生长期的MCF-7细胞，用0.125%的胰酶消化，含血清的培养基中和胰酶，轻轻吹打细胞后离心，弃上清。加培养基重悬细胞，接种于低熔点琼脂糖预处理的96孔板。37℃5%CO2孵箱中培养。肿瘤球生长7 d后，加入无菌过滤后的蒽贝素溶液（40 mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽贝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15 mmol／mL）溶液。以生理盐水为阴性对照，统计肿瘤球体积大小变化。肿瘤球体积变化率 ＝（Vn－V0）／V0。

1.2.5 乳腺癌异位肿瘤模型的建立：MCF-7细胞经胰酶消化离心后，悬浮于DMEM培养液，细胞计数，调节浓度至5×107个／mL。取4～6周龄，体质量20～30 g的雌性裸鼠60只，于皮下接种于裸鼠背部，每只裸鼠接种0.1mL细胞悬浊液。接种后1～2周可见背部长出肿瘤块，证明接种成功。将优选后的40只荷瘤裸鼠随机分成4组，分别腹腔注射蒽贝素溶液（40mmol／mL）、阿霉素溶液（15mmol／mL）和蒽贝素（40mmol／mL）＋阿霉素（15mmol／mL）溶液各 1mL，第 3、6、9、12天给药。第21天处死小鼠，剖肿瘤，称重。计算抑瘤率肿瘤组织切片，TUNEL染色，照相。

1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0进行数据分析，正态计量数据以“±s”表示，2组间比较用t检验，多组间比较用方差分析。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各处理组对MCF-7细胞的增殖抑制作用 MTT结果显示：阿霉素和蒽贝素均能显著抑制MCF-7细胞的增殖（P＜0.05），且随着时间延长抑制率逐渐上升（P＜0.05）。联合干预组对肿瘤细胞的增殖抑制能力显著高于各单独给药组，差异有统计学意义（P＜0.01，见图1）。

图1 不同药物干预组对MCF-7细胞的增殖抑制率＃P＜0.05，＃＃P＜0.01，与生理盐水组比较；**P＜0.01，与蒽贝素组和阿霉素组比较；ΔP＜0.01，与联合干预组相比Fig.1 MCF-7 cell viability at various drugs at24 h and 48h after the treatment＃P＜0.01，compared with saline group；**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group；ΔP＜0.01，compared with combination group（doxorubicin＋embelin）at24 h

2.1 各处理组对MCF-7细胞的凋亡作用 流式检测结果显示：与生理盐水组相比，阿霉素、蒽贝素和联合干预组均能不同程度诱导乳腺癌细胞的凋亡（P＜0.01）。且联合干预组诱导肿瘤细胞凋亡率显著强于2单独干预组组，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图2）。

图2 不同药物干预诱导MCF-7细胞凋亡率ΔP＜0.05，ΔΔP＜0.01，与生理盐水组比较；**P＜0.01，与阿霉素组和蒽贝素组相比Fig.2 MCF-7 cells induced apoptosis by embelin and doxorubicin ΔP＜0.01，compared with saline group；**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group

2.2 各处理组对肿瘤球生长的抑制作用 肿瘤球的生长抑制实验结果显示：阿霉素和蒽贝素均能明显抑制肿瘤球的生长，且联合干预组对肿瘤球生长抑制率显著高于其他2组，差异具有统计学意义（P＜0.01，见图3）。

图3 不同药物干预对肿瘤球生长抑制率**P＜0.01，与蒽贝素组和阿霉素组相比Fig.3 The inhibition of tumor spheroids by embelin and doxorubicin**P＜0.01，compared with embelin group and doxorubicin group

2.4 各处理组对裸鼠皮下移植肿瘤生长的作用 对荷瘤裸鼠的治疗实验表明，联合干预组对肿瘤生长的抑制率显著强于其他组，差异具有统计学意义（P＜0.01，见表1）。各组裸鼠肿瘤组织切片后TUNEL染色，棕色代表凋亡的肿瘤细胞，图4可见，联合干预组诱导凋亡的肿瘤细胞最多，其次是阿霉素干预组和蒽贝素干预组。

表1 不同药物干预对乳腺癌移植瘤的抑制率Tab.1 The inhibition of breast tumor by different drugs

图4 肿瘤组织切片TUNEL染色（×200）Fig.4 TUNEL staining of tumor tissues（×200）

3 讨论

蒽贝素是近年来发现的一种有效的小分子XIAP抑制剂，其抗肿瘤活性已经得到了广泛关注。郑玲等［10］观察了蒽贝素对人胰腺癌细胞的抑制效应，结果显示蒽贝素具有良好的诱导胰腺癌细胞凋亡的作用。史朝晖等［11］观察了蒽贝素对大肠癌细胞的增殖抑制效果，得到了相同的结果。本研究将阿霉素与蒽贝素联合用于乳腺癌的治疗研究。研究结果表明，阿霉素联合蒽贝素能够有效抑制MCF-7肿瘤细胞的增殖和诱导肿瘤细胞凋亡。在某些实体肿瘤组织中，由于肿瘤组织致密生长，肿瘤内部压力高且血管少，因此抗肿瘤药物很难进入肿瘤组织深部［12-15］。本研究构建了体外乳腺癌肿瘤球模型用于评价联合给药的抑制肿瘤生长的能力。结果显示，与生理盐水组比较，蒽贝素和阿霉素都能够抑制肿瘤球的生长，联合给药比各单独给药更能有效抑制肿瘤球的生长。

综上，本研究首先通过体外细胞实验验证了联合给药对乳腺癌细胞的增殖抑制作用。肿瘤细胞增殖抑制实验、肿瘤球生长抑制实验和细胞凋亡实验结果都表明联合给药能够增强乳腺癌细胞的增殖抑制作用，促进肿瘤细胞凋亡。其次，构建了乳腺癌异位肿瘤模型，通过考察肿瘤的生长抑制、肿瘤组织切片观察联合给药对肿瘤的抑制和诱导肿瘤细胞凋亡情况，得到了与体外实验一致的结论：阿霉素联合蒽贝素能够显著提高对乳腺癌的治疗效果。

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（编校：吴茜）

Effect of embelin and doxorubicin on the proliferation of MCF-7 cell and grow th of MCF-7 bearing nudem ice

LIZong-xiang，SUN PingΔ

（Hospital of Central China Agricultural University，Wuhan 430070，China）

ObjectiveTo explore the effect of X-linked inhibitor of apoptosis protein（XIAP）combined with doxorubicin on the proliferation of MCF-7 cell and growth of MCF-7 bearing nude mice.MethodsThe anti-proliferation efficiency of doxorubicin and embelin were determined by MTT assay.MCF-7 cell apoptosis induced by embelin and doxorubicin were detected by Flow cytometry.Anti-tumor ability of embelin and doxorubicin were evalued with tumor spheroids test.MCF-7 cell were xenografted to mice to establish the animal model，which was used to evaluate the effect of antitumor.ResultsCompared with saline group，embelin group and doxorubicin group，the combination（doxorubicin＋embelin）group inhibited the growth of MCF-7 cells effectively（P＜0.01）.The combination group induced the apoptosis of MCF-7 cellsmore effectively than doxorubicin alone（P＜0.01），and significantly inhibit the growth of tumor in vitro and in vivo than other groups（P＜0.01）.ConclusionThe combination of doxorubicin and embelin may be used as a potentially effective treatmentmethod for breast cancer.

doxorubicin；embelin；breast cancer

R737.9

A

1005－1678（2014）04－0005－04

乳腺癌是目前危害妇女健康的主要恶性肿瘤，发病率占女性恶性肿瘤的25%～30%，并呈逐年上升趋势［1-2］。目前，乳腺癌的治疗以手术为主，联合化疗为辅。然而，以细胞毒性为主的化学治疗缺乏选择性，难免产生许多不良反应，导致病人对化疗的依从性较差。凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein，IAPs）是近年来备受瞩目的一类蛋白质家族，是一类独立于Bcl-2的抗凋亡蛋白。某些IAPs成员异常高表达常引起细胞凋亡受阻，与肿瘤的发生发展密切相关［3-5］。X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitorof apoptosis protein，XIAP）是半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶抑制剂。X连锁凋亡抑制蛋白是肿瘤细胞内抑制凋亡发生的重要蛋白之一［6］。蒽贝素是一种XIAP的小分子抑制剂，能够通过抑制XIAP，进而诱导肿瘤细胞凋亡［7-9］。阿霉素是目前临床上常用的抗肿瘤药物，已经被用于乳腺癌的治疗，然而由于其心脏毒性，其应用受到一定的限制。本研究将蒽贝素与阿霉素联用，旨在探讨他们对乳腺癌的治疗作用。

国家自然科学基金（81171365）

李宗祥，男，本科，主治医师，研究方向：肿瘤疾病的基础与临床治疗，E-mail：lizongxiang1975＠163.com；孙平，通信作者，男，本科，主治医师，研究方向：肿瘤疾病的基础与临床治疗，E-mail：2094252562＠qq.com。