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多肽修饰载紫杉醇脂质体靶向A549肺癌干细胞的研究

2014-09-18蔡华荣江跃全

中国生化药物杂志 2014年4期
关键词:脂质体紫杉醇干细胞

蔡华荣,江跃全

(重庆市肿瘤研究所,重庆 400030)

多肽修饰载紫杉醇脂质体靶向A549肺癌干细胞的研究

蔡华荣,江跃全Δ

(重庆市肿瘤研究所,重庆 400030)

目的制备与肺癌干细胞标志物CD133具有高度亲和力的多肽修饰载紫杉醇脂质体(CD133 specific-binding peptide conjugated paclitaxel loaded liposome,TLP-PTX),考察TLP-PTX与A549肺癌干细胞的结合能力及其对A549肺癌干细胞和肺癌干细胞移植瘤的抑制作用。方法采用薄膜分散法制备TLP-PTX,观察其粒径,电位及紫杉醇的包封率等理化性质。采用细胞摄取实验和肿瘤球穿透实验考察TLP-PTX与A549肺癌干细胞的亲和力。通过MTT实验和肺癌干细胞肿瘤球抑制实验观察TLP-PTX对肺癌干细胞的抑制效果。结果制备得到的TLP-PTX粒径为(115.8±8.3)nm,紫杉醇的包封率为88.5%。经过CD133特异性多肽修饰后能够明显增强肺癌干细胞和肿瘤球对脂质体的摄取能力,A549肺癌干细胞对TLP的摄取效率是LP的2.6倍,差异有统计学意义(P<0.05)。MTT实验结果表明TLP-PTX对A549肺癌干细胞的毒性显著强于LP-PTX和紫杉醇溶液(P<0.05);A549肺癌干细胞肿瘤球抑制实验表明TLP-PTX具有良好的抗肿瘤效果。结论TLP-PTX能够特异识别A549肺癌干细胞表面的CD133,介导脂质体进入细胞,抑制肺癌干细胞增殖。TLP-PTX是一种有效的A549肺癌干细胞靶向给药系统。

多肽修饰;紫杉醇;脂质体;CD133;肿瘤干细胞

1 材料与方法

1.1 材料与仪器 人源性肺癌细胞(A549,ATCC)。Sizer Nano ZS90型激光粒度仪及ZETA电位分析仪(英国Malvern instruments Ltd)。大豆磷脂(SPC,上海太伟药业有限公司);DSPE-PEG2000(美国 Avanti polar lipids公司);香豆素-6(coumarin-6,美国 sigma公司);DSPE-PEG2000-MAL(美国 sigma公司);TR肽(序列TISWPPR,苏州强耀生物科技公司);DMEM高糖培养基(美国corning公司);其余试剂为分析纯。

1.2 方法

1.2.1 A549肺癌干细胞培养:采用不含血清的DMEM培养基培养A549肺癌细胞,培养条件为:5%CO2,饱和湿度,温度37℃。待细胞汇合度为0.8~0.9时,用2.5 mg/L胰酶消化传代,取对数生长期细胞进行实验。参照闫秀萍等[6]方法分离得到A549肺癌干细胞:在无血清条件下培养肺癌细胞,利用细胞生长因子诱导球体形成,球体细胞通过检测干细胞标志物及裸鼠成瘤实验,鉴定其肿瘤干细胞的特性。

1.2.2 TLP-PTX的制备及表征:参照Xiong X B等[7]方法合成DSPE-PEG2000-TR。精密称取大豆磷脂18.58 mg,胆固醇1.36mg,DSPE-PEG20002.15mg,DSPE-PEG2000-TR 0.24mg,紫杉醇0.32mg,将以上材料溶于氯仿中,在茄形瓶中减压蒸馏成膜,除去有机溶剂,置于真空干燥器中过夜,使其充分干燥,加入1mL PBS水化,探头超声得到TLP-PTX。采用相同的方法制备得到普通脂质体和载香豆素-6脂质体。取100μL脂质体稀释到100mL,用马尔文激光粒度仪测定粒径和电位。用冷冻高速离心机300 000 r/min离心30min后取上清液,用甲醇破坏脂质体,HPLC法在227 nm检测紫杉醇含量。

1.2.3 A549肺癌干细胞对TLP的摄取观察:培养A549肺癌干细胞,接种于24孔板中,当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时加入一定载香豆素-6脂质体,混合均匀后于5%CO2培养箱中分别孵育1 h和2 h,随后弃去培养基,加入适量PBS清洗3次,加入1mL 1%triton-100裂解细胞,4℃避光裂解0.5 h以上。待裂解完全后,取各组样品200μL在Ex=465 nm,Em=502 nm用荧光分光光度计测定的荧光强度。将脂质体与细胞共同孵育4 h后,将A549肺癌干细胞用PBS漂洗3次,加入2μg/mL DAPI溶液,室温孵育20min,加冰PBS漂洗3次,加4%多聚甲醛固定15min,弃去多聚甲醛,用冰PBS保存。置激光共聚焦荧光倒置显微镜定性观察细胞摄取情况。

1.2.4 MTT实验考察TLP-PTX对A549肺癌干细胞的增殖抑制作用:培养A549肺癌干细胞,接种于96孔板中,当孔板中细胞完全贴壁且处于对数生长期时分别加入TLP-PTX、LP-PTX和PTX溶液。将孔板移入37℃CO2孵箱中分别培养24、48 h后取出,每孔加入20μL 5mg/mLMTT溶液,再放回孵箱中继续孵育4 h,将孔板中液体倒出,每孔加入200μL DMSO,37℃避光振摇15min,用酶标仪在490 nm处测定各孔的光密度值(OD)。

1.2.5 A549肺癌干细胞肿瘤球的构建:培养A549肺癌干细胞接种于96孔板中,将96孔板移入37℃CO2孵箱中培养。7 d后成长为肿瘤球。为了观察不同脂质体对肿瘤球的穿透能力,肿瘤球生长7 d后,分别加入载香豆素-6的TLP和LP,37℃孵育4 h后,将肿瘤球用PBS漂洗3次,加4%多聚甲醛固定15min,弃去多聚甲醛,用冰PBS保存。置激光共聚焦荧光倒置显微镜观察脂质体的肿瘤球穿透能力。为了考察不同载药脂质体对肿瘤球生长的抑制效果,肿瘤球生长7 d后,分别加入TLPPTX、LP-PTX、PTX溶液。以PBS为阴性对照组,统计肿瘤球体积大小变化情况。

1.2.6 统计学方法:采用SPSS 21.0进行数据分析,正态计量数据以“±s”表示,2组间比较用t检验,多组间比较用方差分析。P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TLP-PTX的表征 制备得到的TLP-PTX的粒径在115 nm左右,粒径分布系数PDI<0.3,zeta电位为8.25mV左右,紫杉醇的包封率为88.5%(见表1)。

表1 脂质体的表征Tab.1 Characteristics of liposomes

2.2 A549肺癌干细胞对TLP的摄取 A549肺癌干细胞对不同脂质体的摄取结果如图1所示,经过多肽修饰后2 h脂质体的入胞效率是普通脂质体的2.6倍(P<0.01)。激光共聚焦显微镜定性观察结果如图2所示,TLP组荧光强度显著强于LP。这与定量实验结果相一致。

图1 A549肺癌干细胞对不同脂质体的摄取*P<0.01,与 LP比较;#P<0.01,与1 h比较Fig.1 The uptake of different liposomes by A549 lung cancer cells*P<0.01,compared with LP;#P<0.01,compared with 1 h

图2 A549肺癌干细胞对coumarin-6标记的LP和TLP的摄取(×200)Fig.2 Uptake of liposomes labeled with coumarin-6 by A549 lung cancer stem cells(×200)

2.3 TLP-PTX抑制A549肺癌干细胞的增殖 MTT实验结果如图3所示,TLP-PTX对A549肺癌干细胞的增殖抑制能力显著强于紫杉醇脂质体和游离紫杉醇溶液(P<0.01)。3组药物均能抑制A549肺癌干细胞增殖,这说明A549肺癌干细胞对紫杉醇敏感。给药48 h后,TLP-PTX组肺癌干细胞存活率下降到28%。

图3 TLP-PTX对肺肿瘤干细胞增值的影响*P<0.01,与TLP在24 h比较;#P<0.01,与PTX和LP-PTX比较Fig.3 The cell viability after 24 h and 48 h treatments with various drugs*P<0.01,compared with TLP group at24 h;#P<0.01,compared with PTX and LP-PTX groups

2.4 TLP的肿瘤球穿透能力观察以及TLP-PTX对肿瘤球的生长抑制作用 利用A549肺癌干细胞的快速增殖以及分化能力构建肿瘤球模型,用于评价TLP对肿瘤球的穿透能力以及载药脂质体对肿瘤球的生长抑制能力。肿瘤球穿透实验结果如图4所示,TLP组的荧光强度明显强于LP组,LP组荧光主要存在于肿瘤球的表面,而TLP组荧光则分布在整个肿瘤球组织,说明TLP能够有效的穿透致密的肿瘤组织进入肿瘤内部。

图4 香豆素-6标记脂质体对A549肺癌干细胞肿瘤球的穿透实验(×200)Fig.4 The uptake of coumarin-6 labeled liposomes by A549 lung cancer stem cells spheroids(×200).

脂质体对肿瘤球的生长抑制实验结果如图5所示,给药7 d后,PBS组肿瘤球持续生长,体积增大到原来的1.48倍,TLPPTX、LP-PTX和PTX均能抑制肿瘤球的生长,与细胞增殖抑制实验结果相一致。LP-PTX使肿瘤球体积减小到原体积的79%,LP-PTX组肿瘤球体积大小基本不变,PTX溶液使肿瘤球体积减小到原体积的91%。

图5 给药7 d后肿瘤球体积变化Fig.5 The change ratio of tumor spheroid after 7 days

3 讨论

近年来,随着肿瘤分子生物学的研究发展,越来越多的研究已经表明在肿瘤组织中存在着数量稀少的一类癌细胞,在肿瘤形成过程中充当干细胞的角色,具有自我更新、增殖和分化的潜能,虽然数量少,却在肿瘤的发生、发展、复发和转移中起着重要作用,由于其众多性质与干细胞相似,所以这些细胞被称为肿瘤干细胞(Cancer stem cells,CSCs)[8-9]。随着对肿瘤干细胞研究的深入,越来越多的肿瘤干细胞标志物被发现,其中CD133是被研究最广泛的一种肿瘤干细胞标志物。有研究证实[10-12],肺癌干细胞属于CD133+细胞亚群,此类肿瘤干细胞具有球体形成能力以及快速增殖分化能力。因此CD133成为肺癌治疗研究的新靶点。序列为TISWPPR的TR肽是通过噬菌体展示技术得到的与CD133具有高度亲和能力的短肽。田平阁等[7]已经通过研究证实TR肽能够与高度表达CD133的结肠癌干细胞具有高度亲和性。本研究将TR肽连接到脂质体的表面,以紫杉醇为模型药物,考察TR肽修饰的脂质体与A549肺癌干细胞的亲和力以及载药脂质体对肺癌干细胞的抑制效果。

本研究采用薄膜分散法制备了与CD133特异性结合肽修饰载紫杉醇脂质体,粒径在115 nm左右,紫杉醇的包封率为88%。通过A549肺癌干细胞对脂质体的定量和定性摄取实验证实了TLP与高度表达CD133的肺肿瘤干细胞具有良好的结合能力,CD133能促进肺癌干细胞对脂质体的摄取并介导脂质体入胞。这说明TR肽与高度表达CD133的肿瘤干细胞具有较好的亲和力。通过MTT实验证实了该脂质体对脑肿瘤干细胞的抑制能力。肿瘤干细胞作为肿瘤生长的源动力,抑制肿瘤组织内部的肿瘤干细胞将有助于从根本上抑制肿瘤组织的发展。在某些实体肿瘤组织中,由于肿瘤组织致密生长,肿瘤内部压力高且血管少,因此给药系统很难进入肿瘤组织内部[13-15]。本研究构建了肿瘤球模型旨在模拟脂质体在体内肿瘤组织的分布情况以及对实体瘤组织的抑制能力。结果显示TLP-PTX具有很好的肿瘤球穿透能力和抑制能力。

综上所述,本研究制备得到的CD133特异性多肽修饰载紫杉醇脂质体能够高效靶向抑制肺癌干细胞,是一种潜在的肺癌干细胞靶向给药系统。该给药系统的体内肿瘤靶向性和肿瘤抑制能力研究正在进一步进行中。

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(编校:吴茜)

Study on the ability of specific-binding peptidemodified liposome loaded paclitaxel targeting A549 lung cancer stem cell

CAIHua-rong,JIANG Yue-quanΔ

(Chongqing Cancer Institute,Chongqing 400030,China)

ObjectiveTo prepare CD133 specific-binding peptide conjugated liposome loaded paclitaxel and evaluate the efficiency of cellular uptake and the ability of inhibiting A549 lung cancer stem cell.MethodsLiposomes were prepared by film-ultrasonic method.The partical size,zetapotential and entrapment efficiency of liposomeswere evaluated.Cellular uptake effciency of A549 lung cancer stem cell for liposomeswere explored.The anti-proliferation efficiency of TLP-PTX to A549 lung cancer stem cell was evaluated by MTT assay.Tumor spheroids were used to evaluate anti-tumor ability of TLP-PTX to A549 lung cancer stem cell.ResultsThe particle diameter of TLP-PTX was(115.8±8.3)nm and the entrapment efficiency of PTX was88.5%.CD133 specific-binding peptide could enhance the efficiency of cellar uptake.The uptaken efficiency of TLP by A549 lung cancer stem cellwere 2.6 times higher than that of LP(P<0.05).The MTT Results showed that the toxicity of TLP-PTX on A549 lung cancer stem cell was significantly stronger than LP-PTX and paclitaxel solution(P<0.05).The tumor inhibition test results showed that TLP-PTX has good anti-tumor effect.ConclusionTLP-PTX can specifically recognize the surface marker CD133 of A549 lung cancer stem cell,facilitate liposomes into cells and inhibit A549 lung cancer stem cell proliferation.TLP-PTX is an effective drug delivery system targeting to A549 lung cancer stem cell.

peptidemodified;paclitaxel;liposomes;CD133;neoplastic stem cells

R734.2

A

1005-1678(2014)04-0012-04

肺癌是全球最普遍发生的恶性肿瘤之一,其发病率和死亡率居恶性肿瘤之首[1]。近年来,我国肺癌的发病率呈急剧上升趋势。手术和放化疗是当前肺癌治疗的主要手段,然而由于肺癌的复发和转移使得肺癌的疗效止步不前。现在研究已经证实多种实体肿瘤中存在肿瘤干细胞,包括乳腺癌、胰腺癌、头颈瘤、结肠癌、肝癌、膀胱癌、卵巢癌[2]以及肺癌[3]等。肿瘤的复发和转移是由于肿瘤干细胞具有耐药和耐辐射的特性以及肿瘤干细胞高度的分化能力和致瘤能力[3]。有学者研究发现,肺癌干细胞表面有大量CD133表达[4]。有研究表明[4],A549肺癌干细胞表面大量表达 CD133,TR肽是一种与 CD133高度亲和的短肽[5]。因此本研究旨在将与CD133具有高度亲和力的多肽连接到脂质体表面,研究其靶向A549肺癌干细胞的作用,以期实现肺癌干细胞的靶向治疗。

国家自然科学基金(30970843)

蔡华荣,男,硕士,主治医师,研究方向:肿瘤干细胞的靶向研究,E-mail:caihuarong1977@163.com;江跃全,通信作者,男,博士,主任医师,研究方向:肿瘤干细胞的靶向研究。

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