鹿瓜多肽注射液对PMMA颗粒诱导的小鼠颅骨骨溶解抑制作用的实验研究

陈 雷，李长德，于 洋，张志光

(1.佳木斯大学附属第二医院，黑龙江佳木斯154002；2.佳木斯大学附属第一医院，黑龙江佳木斯154003)

人工关节置换术最普遍的并发症就人工关节无菌性松动，而人工关节无菌性松动的直接原因就是关节假体周围的骨溶解。大量实验表明，磨损微粒是引起骨溶解的主要原因［1］。主要磨损微粒有骨水泥颗粒(PMMA)聚乙烯颗粒(UHMPE)、钛合金微粒等。这些磨损颗粒通过刺激假体周围组织中的炎性细胞分泌大量的炎症因子如TNF-α、IL-l、IL-6及PGE2等来进一步刺激活化破骨细胞促进骨吸收［2］。炎症因子还可以减弱成骨细胞的活性，使胶原合成减少，降低成骨细胞的成骨能力；也可促使前体细胞向破骨细胞分化，从而使破骨细胞凋亡受到抑制，进而破骨细胞的活性得到增强，所以关节假体周围的骨溶解并不是人工关节无菌性松动的唯一原因，而关节假体周围的骨成骨能力下降，骨吸收能力升高等共同作用，破坏了骨生成与骨吸收的动态平衡，进而引起假体周围骨溶解，导致人工关节假体的无菌性松动［3］。本实验通过建立小鼠体内PMMA颗粒颅骨溶解模型，来研究鹿瓜多肽注射液在PMMA颗粒诱导小鼠颅骨溶解及破骨细胞形成及功能中的作用，为临床运用鹿瓜多肽注射液预防和治疗人工假体周围骨溶解导致的人工关节假体无菌性松动提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

实验动物采用BALB/C7-9周龄的清洁级小鼠，由佳木斯大学动物实验中心提供，鹿瓜多肽注射液(哈尔滨誉衡药业有限公司)，PMMA颗粒(上海倍尔康生物医学科技有限公司)，ELISA TNF-a 、IL-1、IL-6、PGE2 试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)。

1.2 PMMA颗粒

实验用磨损颗粒采用PMMA颗粒(上海倍尔康生物医学科技有限公司)，形态规则，平均直径0.2～0.5μm。首先将PMMA颗粒溶于75%乙醇，室温下震荡洗浴4次，每次1小时，然后经100%乙醇浸泡过夜后用PBS震荡清洗4次，每次1小时，最后将处理好的PMMA颗粒重悬于α-MEM培养基中，配成浓度为30g/L的溶液，4℃保存备用。经此处理后根据商业检测试剂盒(厦门市鲎试剂实验厂有限公司)检测，颗粒内毒素小于0.25Eu/mL。

1.3 小鼠颅骨的骨吸收模型建立

每只小鼠采用3%的水合氯醛腹腔内注射，待麻醉满意后，备皮刀剔除小鼠头顶部毛，碘伏术区消毒，在小鼠颅骨正中矢状缝位置头皮切开大小约0.5cm×0.5cm，暴露颅骨外骨膜，注意保护骨膜，显现冠状缝、矢状缝及人字缝，取100μL不含PMMA颗粒的α-MEM及30g/L PMMA颗粒的α-MEM悬液置于切口处，1号线间断缝合头部皮肤，防止悬液漏出。术毕小鼠清醒后按照实验要求喂养及注射各种药物。

1.4 ELISA 法检测血清 TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2 水平

2周后小鼠麻醉后，取腹主动脉血，静置，3000r/min离心10min，取血清于EP管中，-20℃保存备用。每孔分别加入样品、样品稀释液、标准品各100μL，37℃温育30min后加入酶标偶合液、底物、终止液50μL，于450nm波长读取OD值。

1.5 小鼠颅骨组织切片制备及组织学分析

制备方法参考 Warashina等［4］实验步骤。具体如下：2周后所有小鼠脱颈处死，取颅骨盖帽。固定，脱钙、脱水、石蜡包埋，正中矢状缝上切开颅骨为左右两半，以切面向下包埋组织。石蜡切片4.5μm，在正中矢状缝两侧各切两张，分别行HE染色，TRAP(抗酒石酸酸性磷酸酶)染色。TRAP染色方法详见试剂盒使用说明书。

2 结果

空白组A组细胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量最低，单纯PMMA颗粒处理B组细胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量最高。PMMA颗粒处理各组细胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量均较空白对照A组明显增加，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。经过鹿瓜多肽注射液治疗的 C、D、E 组细胞液中的 TNF- α、IL-1、IL-6、PGE2的含量较单纯PMMA颗粒处理的B组细胞液中的TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2含量降低，差异有显著性意义(P ＜0.05)。其中E组降低最为明显，与C、D组比较，差异有显著性意义(P＜0.05)。5mL/kg鹿瓜多肽注射液C组与10mL/kg鹿瓜多肽注射液D组之间比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。20mL/kg鹿瓜多肽注射液E组与单纯PMMA颗粒处理B组之间差异有非常显著性意义(P＜0.01)。见表1。

表1 各组血清TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2表达()

表1 各组血清TNF-α、IL-1、IL-6、PGE2表达()

*阴性组与其他各组的差异有统计学意义。★阳性组与其他各组的差异有统计学意义。

组别 TNF-α IL-1 IL-6 PGE2 A组 65.54±1.69★ 57.63±2.14★ 24.57±2.32★ 20.46±1.16★B组 155.79±2.36* 135.89±4.17* 80.51±3.62* 78.74±2.26*C 组 136.34±3.76＊★ 117.73±5.23＊★ 69.35±2.81＊★ 65.67±3.44＊★D 组 125.51±2.47＊★ 103.57±3.48＊★ 61.61±2.56＊★ 58.23±2.13＊★E 组 81.84±1.37＊★ 73.62±2.42＊★ 42.67±1.48＊★ 39.33±2.48＊★

HE染色提示在置入PMMA颗粒后，在颅顶骨的骨吸收明显增加，骨小梁结构紊乱及骨计算颅骨正矢状线骨破坏溶解面积。PMMA颗粒处理各组颅骨正矢状线骨破坏溶解面积均较空白对照A组明显增加，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。经过鹿瓜多肽注射液干预的各组骨破坏溶解面积较单纯 PMMA颗粒处 B理组减少，差异有显著性意义(P＜0.05)。而鹿瓜多肽注射液各组间比较可知20mL/kg鹿瓜多肽注射液E组的骨破坏溶解面积最少，与其他2组相比，差异有显著性意义(P＜0.05)，5mL/kg鹿瓜多肽注射液C组与10mL/kg鹿瓜多肽注射液D组之间比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。20mL/kg鹿瓜多肽注射液E组与单纯PMMA颗粒处理组之间差异有非常显著性意义(P ＜0.01)。见表2。

表2 各组间骨破坏溶解面积差异比较()

表2 各组间骨破坏溶解面积差异比较()

*阴性组与其他各组的差异有统计学意义。★阳性组与其他各组的差异有统计学意义。

实验组 骨破坏溶解面积A组 0.068±0.014★B组 0.437±0.021*C 组 0.204±0.021＊★D 组 0.178±0.024＊★E组 0.107±0.052＊★

TRAP染色表明在置入PMMA颗粒后破骨细胞数目增加。PMMA处理各组中，破骨细胞数目均较空白对照A组明显增加，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。经过鹿瓜多肽注射液干预的各组中，破骨细胞数目较单PMMA处理B组减少，差异有显著性意义(P＜0.05)。而鹿瓜多肽注射液干预的各组间比较可知20mL/kg直射用鹿瓜多肽E组的破骨细胞数目最少，与其他2组相比，差异有显著性意义(P ＜0.05)，5mL/kg鹿瓜多肽注射液C组与10mL/kg鹿瓜多肽注射液D组之间比较，差异无显著性意义(P＞0.05)。20mL/kg鹿瓜多肽注射液E组与单纯PMMA处理B组之间比较，差异有非常显著性意义(P＜0.01)。见表3。

表3 各组间实验区域破骨细胞数差异比较()

表3 各组间实验区域破骨细胞数差异比较()

*阴性组与其他各组的差异有统计学意义。★阳性组与其他各组的差异有统计学意义。

实验组 破骨细胞个数A组 8.1±1.3★B组 30.4±3.6*C 组 21.7±2.4＊★D 组 19.5±1.7＊★E组 10.2±2.2＊★

3 讨论

当今全球每年有超过数百万台人工关节置换手术，而人工关节无菌性松动也就成为全球范围内最为普遍的人工关节置换术并发症，大量实验表明，磨损微粒是引起骨溶解的主要原因［1］。主要磨损微粒有骨水泥颗粒(PMMA)聚乙烯颗粒(UHMPE)、钛合金微粒等。这些磨损颗粒通过刺激假体周围组织中的炎性细胞分泌大量的炎性因子如TNF-α、IL-l、IL-6及PGE2等来进一步刺激活化破骨细胞促进骨吸收［2］。

大量研究都集中在TNF-α介导炎性界膜的形成。这些细胞(主要是巨噬细胞)在磨损颗粒刺激下可以产生多种炎性介质和多种细胞因子，其中 TNF-α、IL-l、IL-6、PGE2、核因子B受体活化因子配体等在诱导细胞增殖、破骨细胞形成及骨吸收等方面起着重要的作用［5］。破骨细胞是从单核-巨噬细胞系的破骨细胞前体细胞分化来的多核细胞，是骨吸收中最重要的细胞。磨损颗粒促使破骨细胞前体细胞向破骨细胞分化是一个复杂的过程，包括磨损颗粒地直接作用和与巨噬细胞引起假体周围细胞因子环境的变化有关。巨噬细胞在磨损颗粒不断的刺激下，产生大量促炎性递质和蛋白水解酶类。尤其是 TNF- α、IL-l、IL-6、PGE2、巨噬细胞集落刺激因子等，使破骨细胞前体细胞向破骨细胞的分化增值，最后导致骨溶解吸收［6，7］。

本实验应用的鹿瓜多肽注射液：为复方制剂，其组分为：鹿科动物梅花鹿(Cervus Nippon Temmick)的骨骼和葫芦科植物甜瓜(Cucumismelo L.)的干燥成熟种子，经分别提取后制成的灭菌水溶液。鹿瓜多肽注射液中的骨诱导多肽类生物因子可有效促进机体内影响骨形成和吸收的骨源性生长因子的合成。包括骨形态发生蛋白(BMPs)，β-转化生长因子(TGF-β)，成纤维细胞生长因子(FGF)等，从而具有多种生物活性，调节骨矿物质代谢、抑制骨破坏、减少破骨作用、促进骨代谢平衡而治疗骨质疏松的作用。其主要药理作用有：促进细胞有丝分裂，分化作用，趋化作用和溶骨活性，其中BMPs是一组酸性低分子量糖蛋白，作为一种高效骨诱导物质，BMPs是间充质细胞向骨系细胞分化的最初信号分子，能诱导血管周围游动的间充质细胞转化为不可逆性的骨系细胞，即软骨细胞和成骨细胞，从而促进新骨形成，增加骨钙沉积；此外，BMPs还可调节细胞外基质成分的改变。并通过与TGF-β和FGF相互之间的协调作用更好地诱导新骨形成，使骨组织更成熟。TGF-β则是一族具有多种功能的蛋白多肽，对成骨细胞及成软骨细胞有促进分化或降低分化的双重调节作用，与多种因子如细胞外基质和其他分化调节生长因子一起协同参与对细胞分化的调节；TGF-β可促进细胞外基质合成，可以直接刺激成纤维细胞外基质的合成，并对其新合成的基质降解有显著抑制作用；对于成骨细胞，TGF-β可促进其合成Ⅰ型胶原，骨粘连素和骨桥蛋白；同时，TGF-β对淋巴细胞和巨噬细胞的作用表明，它即能缓解炎性反应的破坏性，又能协助巨噬细胞来源的某些细胞因子在组织修复中发挥作用。FGF是一组肝素黏合多肽，可刺激细胞的趋向移动，增殖和分化，增加合成胶原细胞的数量，促进骨胶原蛋白及非胶原蛋白的合成，增加骨钙素的合成。甜瓜籽提取物是从葫芦科植物甜瓜(Cucumismelo L.)的成熟干燥的种子经特殊工艺提取而成，能降低骨折局部毛细血管通透性，减少炎性渗出，促进局部血运障碍的恢复；同时还能降低全血粘度及红细胞聚集程度，改善骨痂局部的血液循环，为骨细胞提供一个良好的供血环境，另外还能抑制前列腺素的释放，降低PGE2含量，在促进骨折早期愈合中，甜瓜籽提取物与补充的骨诱导多肽类生物因子具有协同作用，促进骨源性生长因子的合成。鹿瓜多肽注射液富含的多种游离氨基酸，为骨细胞合成BMPs、TGF-β、FGF等骨源性生物因子提供原料，促进骨源性生物因子的合成。有机钙、磷离子可参与钙磷代谢，维持骨容量。

综上所述，鹿瓜多肽注射液理论上能够调节骨矿物质代谢、抑制骨破坏、减少破骨作用、促进骨代谢平衡。能够抑制磨损颗粒刺激产生的IL-1、IL-6、TNF-α及PGE2等炎性因子的作用，从而抑制破骨细胞引起的骨溶解导致的人工关节松动。

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［5］邵振兴，蒋青.假体周围骨质溶解细胞分子生物学研究［J］.国际骨科学杂志，2007，28(3)：170 173

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