HPLC法同时测定白屈菜中白屈菜碱和白屈菜红碱

马 宁，肖光玲，高 宇，李彦冰

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨150040)

白屈菜又名地黄连、牛金花、土黄连、断肠草、雄黄草、假黄连，为罂粟科白屈菜属植物白屈菜(Chelidonium majus L)的全草.味苦，性凉.有毒.具有解痉止痛、止咳平喘的功能，用于胃脘挛痛、咳嗽气喘、百日咳[1].其主要的活性成分为异喹啉类生物碱，包括白屈菜碱、白屈菜红碱、血根碱、小檗碱、原阿片碱等[2].本文采用反相高效液相色谱法[3-5]同时测定了药材白屈菜中含白屈菜碱和白屈菜红碱的量.

1 仪器与试药

戴安Ultimate3000高效液相色谱仪(VWD-3400型紫外检测器、LPG-3400A型泵、WPS-3000型自动进样器、TCC-3000型柱温箱、Chromeleon色谱工作站)；KQ-250E型超声波清洗器(昆山超声仪器有限公司)；电子分析天平(AB204-N，梅特勒-托利多仪器上海有限公司).

乙腈为色谱纯；磷酸、盐酸、二氯甲烷均为分析纯；水为娃哈哈纯净水.对照品：白屈菜碱(四川省维克奇生物科技有限公司，批号：120530)，白屈菜红碱(中国药品生物制品检定所，批号：111718-200501)，白屈菜药材购于哈尔滨市药材市场，由黑龙江中医药大学药学院李彦冰教授鉴定为白屈菜(Chelidonium majus).

2 方法与结果

2.1 溶液制备

2.1.1 混合对照品溶液制备

精密称取对照品白屈菜碱5.00 mg、白屈菜红碱5.00 mg，置于10 mL量瓶，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，制成混合对照品储备液.精密吸取混合对照品储备液1 mL，置于10 mL量瓶，用甲醇稀释至刻度，制成混合对照品溶液.

2.1.2 供试品溶液

称取白屈菜药材粗粉，加10倍量的95%乙醇，回流3次，每次40 min，收集醇提液，减压回收乙醇得稠膏，用1 mol/L盐酸调pH值至2～3，静置过夜，过滤，用1 mol/L氢氧化钠溶液调pH值至9～10，用等量的二氯甲烷萃取6次(至水层无生物碱显色反应)，收集二氯甲烷液，回收二氯甲烷，干燥至恒重，得白屈菜药材二氯甲烷萃取物.称取1 g二氯甲烷萃取物置于100 mL量瓶，用甲醇溶解，摇匀定容，备用.

2.2 色谱条件

色谱柱：依利特Hypersil ODS2(4.6 mm×200 mm，5 μm)；流动相: 乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液(38∶62，磷酸二氢钾水溶液用磷酸调至pH=3)；流速：1.0 mL/min；检测波长：282 nm；柱温：35 ℃，进样量20 μL，在上述色谱条件下，对照品及样品色谱图见图1.

A图1-白屈菜碱 2-白屈菜红碱; B图3-白屈菜碱 7-白屈菜红碱图1 混合对照品(A)、药材样品(B)的HPLC图

2.3 线性关系考察

精密吸取混合对照品溶液(50 μg/mL)5、10、15、20、25、30 μL依次注入高效液相色谱仪中，记录峰面积.按上述色谱条件进行测定以混合对照品进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线.白屈菜碱、白屈菜红碱的回归方程分别为：Y=20.823X-0.0005R2=0.9999、Y=53.058X-0.0625R2=0.9999结果表明白屈菜碱和白屈菜红碱进样量均在0.25～ 1.50 mg范围内与峰面积线性关系良好.

2.4 精密度试验

按照“2.1.1”项下制备混合对照品溶液，分别精密吸取混合对照品溶液20 μL，共6次，按“2.2”项下色谱条件操作，记录6次白屈菜碱和白屈菜红碱的峰面积，RSD值(n=6)分别为0.25%，0.19%.结果表明，仪器精密度良好.

2.5 稳定性试验

精密称取白屈菜药材二氯甲烷萃取物按照“2.1.2”项下制备供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、10 h进样，按“2.2”项下色谱条件操作，记录峰面积值，RSD值分别为0.27%、0.32%，结果表明，供试品中白屈菜碱和白屈菜红碱在10 h内基本稳定.

2.6 重复性试验

精密称取白屈菜药材二氯甲烷萃取物按“2.1.2”项下制备供试品溶液，进样量20 μL，进样6次，按“2.2”项下色谱条件操作，记录白屈菜碱和白屈菜红碱的峰面积，RSD值分别为0.49%、0.52%，结果表明，该方法的重复性良好.

2.7 加样回收试验

精密称取同一已知含量二氯甲烷萃取物6份，每份0.5 g，分别按二氯甲烷萃取物中白屈菜碱和白屈菜红碱含有量的100%加入混合对照品溶液适量，按“2.1.2”项下供试品溶液的制备方法, 依照“2.2”项下色谱条件操作,记录峰面积，计算回收率，平均加样回收率白屈菜碱和白屈菜红碱分别为(n=6)98.72%、97.34%，RSD=0.65%、0.86%，表明该方法准确.

2.8 样品的测定

称取干燥后的白屈菜药材粉末，按“2.1.2”项下制备供试品溶液，测得3批白屈菜药材二氯甲烷萃取物中含白屈菜碱量分别为5.688、5.687、5.686 mg/g；含白屈菜红碱量分别为2.719、2.717、2.718 mg/g.

3 结 语

本试验曾采用不同的流动系统，对乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液系统不同比例进行试验，结果采用乙腈-0.01 mol/L磷酸二氢钾水溶液(38∶62)流动相系统时，所测得白屈菜碱峰和白屈菜红碱峰均与其他组分峰能达到较好的分离.

参考文献：

[1] 国家药典委员会.中华人民共和国药典一部[M]. 北京: 中国医药科技出版社, 2010.

[2] 黄 松, 杜方麓. 罂粟科白屈菜族的化学成分及植物化学分类依据的研究进展[J]. 湖南中药导报, 2002, 8(10):582-584.

[3] 左金梁, 白 璐, 宋欣鑫, 等. RP-H PLC法同时测定白屈菜药材中血根碱、小檗碱和白屈菜红碱的含量[J].药物分析杂志, 2008, 28(6):903.

[4] 安彩贤, 杨广德, 叶建涛, 等.RP-HPLC法同时测定小博落回中血根碱和白屈菜红碱的含量[J].中成药, 2001, 23(11):824.

[5] 季宇彬，孟凡影，曲中原，等.白屈菜碱对SGC-7901细胞Cdk1、cyclinB1表达影响[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2012，28(1)：1-3.