马钱子碱固体脂质纳米粒包封率的测定

张 亮，管庆霞，赵义军，高佳翔，李永吉

(黑龙江中医药大学 药学院，哈尔滨 150040)

马钱子碱为中药马钱子的有效成分，具有显著的镇痛、抗炎、抗肿瘤、中枢神经系统兴奋等作用[1]，但其溶解度差，半衰期短，生物利用度较低.固体脂质纳米粒，物理稳定性高，毒性低，兼有控释和长效制剂的优势，长期以来成为口服和静脉给药制剂的研究热点，是一种极具发展前景的新型给药系统[2].本实验以马钱子碱为模型药物，采用乳化蒸发法制备马钱子碱固体脂质纳米粒.固体脂质纳米粒的药物包封率是处方工艺筛选与质量评价的重要指标，也是其发挥疗效的关键，而载药固体脂质纳米粒包封率的测定，涉及游离药物与固体脂质纳米粒的良好分离.本实验旨在采用葡聚糖凝胶法进行分离，以HPLC测定溶液中马钱子碱的质量浓度，计算包封率，并为固体脂质纳米粒的包封率测定提供参考.

1 仪器与材料

Waters公司高效液相仪系统(2996 photodiode Array Detector，2695 separations module，Empower色谱工作站)；85-2A恒温磁力搅拌器(金坛市荣华仪器制造公司)；AB265-S电子分析天平(德国梅特勒公司).

马钱子碱原料药(日本和光纯药株式会社)；马钱子碱对照品(中国药品生物制品检定所)；Poloxamer 188(德国BASF公司)；卵磷脂(北京双旋微生物培养制品厂)；单硬脂酸甘油酯(分析纯，天津市化学试剂三厂)；葡聚糖G-50(美国Pharmacia公司)；色谱甲醇(Sigma 公司)；水为重蒸馏水，其他试剂均为市售分析纯.

2 方法与结果

2.1 马钱子碱固体脂质纳米粒的制备

采用乳化溶剂低温固化法[3]制备马钱子碱固体脂质纳米粒.将处方量的马钱子碱和单甘脂溶于无水乙醇中，超声溶解，再加入适量的卵磷脂，微热形成有机相，另取处方量的泊洛沙姆188溶于水中，构成水相.在搅拌下将有机相缓慢注入水相中，整个过程保持温度脂质材料熔点以上，继续搅拌数小时，浓缩体积至原来的1/3左右，将所得的半透明体系快速混于另一低温水相中，继续搅拌固化，即得固体脂质纳米混悬液.

2.2 色谱条件

色谱柱：Dikma C18ODS(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相∶甲醇(30%)∶水-乙酸-三乙胺(230∶2.4∶0.3)(70%)；流速：1 mL/min；检测波长：265 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μL.

2.3 标准曲线的绘制

取马钱子碱对照品5.06 mg，精密称定，置50 mL的量瓶中，用甲醇溶解并定容，摇匀得质量浓度为 0.101 2 mg/mL的对照品贮备液.分别精密吸取对照品溶液0.2、0.6、1、2、3、4 mL至10 mL的量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，在“2.2”项下色谱条件下，进样10 μL，以峰面积Y对马钱子碱质量浓度X进行回归，求得回归方程为:Y=0.1150X+0.1896(r=0.999 9).结果表明，马钱子碱在2.024～40.48 μg/mL质量浓度范围内与峰面积线性关系良好.

2.4 精密度和回收率

在线性范围内配制马钱子碱高、中、低质量浓度的标准液，于1 d内进样5次，分别计算回收率及日内精密度.结果表明，回收率在99.3%～100.3%之间，日内精密度值为1.2%，结果表明，该法灵敏度高、重复性好.

2.5 马钱子碱固体脂质纳米粒包封率的测定

2.5.1 葡聚糖凝胶柱的装填

取一定量Sephadex G-50，用蒸馏水浸泡，沸水浴上加热30 min，使葡聚糖充分溶涨并除去气泡，静置，沉淀葡聚糖，然后填充到玻璃层析柱上，不断加入蒸馏水，以除去气泡.以水洗柱，平衡待用.

2.5.2 洗脱曲线的绘制

精密吸取马钱子碱纳米粒溶液1 mL，加于葡聚糖凝胶G-50柱顶部，以蒸馏水洗脱，流速1 mL/min，收集洗脱液，每份1 mL，共收集30份，过0.22 μm滤膜，取续滤液按“2.2”项下色谱条件进行HPLC测定，再将前15 mL每份分别用甲醇定容至2 mL，超声静置.上清液过0.22 μm的滤膜，取续滤液按“2.2”项下色谱条件进行HPLC测定，以洗脱体积为横坐标，溶液中马钱子碱质量浓度为纵坐标，制备洗脱曲线，结果见图1.

图1 马钱子碱固体脂质纳米粒的洗脱曲线

2.5.3 柱回收率的测定

精密量取已知含量的游离马钱子碱溶液1 mL，加于葡聚糖凝胶柱顶部，以蒸馏水洗脱，控制流速，收集20～30 mL洗脱液，用甲醇定容至50 mL量瓶中，摇匀.精密吸取10 μL溶液，按“2.2”项下色谱条件进样，测定过柱后马钱子碱的质量浓度(见表1)，平均柱回收率为91%，RSD为1.5%，回收率较高，重现性较好，此方法可行.

表1 游离马钱子碱的柱回收率测定结果(n=3)

2.5.4 包封率的测定

精密量取马钱子碱纳米混悬液1 mL，上SephadexG-50柱，以蒸馏水洗脱，流速为1 mL/min，以试管收集7～14 mL洗脱液(含马钱子碱的固体脂质纳米粒)，加入甲醇超声破乳并定容至50 mL，静置.上清液过0.22 μm的有机微孔滤膜，取续滤液按“2.2”项下条件测定质量浓度，计算包封的药物量，为WE.另外精密量取马钱子碱纳米混悬液1mL，用甲醇超声破乳，定容至50mL，静置，上清液过0.22μm的有机微孔滤膜，取续滤液按“2.2”项下条件测定质量浓度，计算药物总质量浓度，为WTotal.以包封率(EE%)=WE/WTotal×100%计算，马钱子碱平均包封率为68.13%，RSD值为0.59%.见表2.

表2 包封率测定结果(n=3)

3 讨 论

1) 固体脂质纳米粒的包封率测定方法主要有透析法[4]、离心法[5]、和葡聚糖凝胶柱层析法等[6]，其原理均是采用一定的方法使包封药物与游离药物分离，测定二者的质量浓度，计算包封率.本实验采用葡聚糖凝胶柱层析法，利用分子筛原理，依据分子的大小不同而得到分离.该法操作简单，避免了透析法耗时长、被包封药物易渗漏而造成结果偏低的缺点以及离心法在离心过程中可能发生的纳米粒变形与破裂的不足.

2) 样品处理时，根据纳米粒载体材料和马钱子碱的溶解性质，选择了甲醇、无水乙醇、丙酮、乙腈为破乳剂.结果发现甲醇的破乳效果较好，加入后进行超声，可见溶液不带蓝色乳光(破乳完全)，最终选择甲醇为破乳剂.

3) 本实验测定结果表明，葡聚糖凝胶柱层析法柱回收率较好，测得的包封率较高，此法适用于马钱子碱固体脂质纳米粒的包封率测定.

参考文献：

[1] 李永吉, 张欣媛, 管庆霞, 等.浅议马钱子研究进展[J].中医药学报, 2011, 39(4): 104.

[2] JORES K, HABERLAND A, WARTEWIG S,etal. Solid lipid nanoparticles and oil-loaded SLN studied by spectrofluorometry and Raman spectroscopy[J]. Pharmaceutical Research, 2005, 22(11): 1887-1897.

[3] 管庆霞, 郭玉岩, 赵权涛, 等. 正交实验法优选马钱子碱固体脂质纳米粒制备工艺[J]. 时珍国医国药, 2012, 12(23): 3063.

[4] 李 同, 陈桐楷, 林华庆, 等. 石杉碱甲固体脂质纳米粒包封率的测定方法研究[J]. 广东药学院学报, 2010, 26(2): l12-ll4.

[5] 宫金岩, 胡连栋, 刘 洋, 等. 维甲酸固体脂质纳米粒中主药的含量及包封率测定[J]. 中国药房, 2008, 19(16): l252-1253.

[6] 李伟男，于 鑫,王莹莹，等.马钱子总生物碱树脂复合物的制备及结合机制[J].哈尔滨商业大学学报：自然科学版，2013，29(3)：265-270.