HPLC法测定眼用伏立康唑纳米结晶混悬液含量

戴助 (长江大学临床医学院 荆州市第一人民医院药学部，湖北 荆州 434000)

眼部真菌感染是一种缺乏特异有效治疗方法、严重威胁视力的眼部感染性疾病，临床局部药物治疗缺乏敏感是该病治疗失败的主要原因［1］。伏立康唑作为新型第三代抗真菌药对多种眼部致病真菌具有更强抗菌活性 (例如其体外抗菌活性是氟康唑的50～100倍)［2］，在临床上有着不可替代的地位。为了解决伏立康唑的溶解性能、增加眼部用药的生物利用度，本课题组前期构建了稳定的伏立康唑纳米结晶混悬液。本文采用高效液相色谱法 (HPLC)测定此产品中伏立康唑含量，为下一步伏立康唑眼用制剂的开发提供理论依据。

1 仪器与试剂

Dionex P680高效液相色谱仪:四元泵、紫外检测器、Chromeleon色谱工作站 (美国);Hypersil C18色谱柱 (大连伊利特);伏立康唑对照品 (批号:090621)，0.5%伏立康唑纳米结晶混悬液 (实验室制备);甲醇、乙腈 (ThermoFisher色谱纯)，磷酸二氢铵、氨水均为分析纯。

2 实验方法与结果

2.1 色谱条件

参考HPLC测定伏立康唑的文献［3-5］，对流动相比例进行调整，确定流动相为0.04mol/L磷酸二氢铵溶液 (用氨水调节pH值至6.0)-乙腈 (60∶40)，流速为1.0ml/min;色谱柱为Hypersil ODS C18色谱柱 (4.6mm×150mm，5μm)，进样量为20μl;取浓度为 20μg/ml的伏立康唑对照品溶液在190～450nm范围内进行紫外扫描，结果显示在256 nm处伏立康唑有最大特征吸收，确定紫外检测波长为256nm。

2.2 专属性考察

按“2.1”项下色谱条件，将伏立康唑对照品和伏立康唑纳米结晶混悬液样品分别进样测得色谱图(图1)，从图1可知对照品与样品中伏立康唑主成分峰保留时间一致，样品中杂质峰对主成分峰无干扰，分离度大于3.0。

图1 伏立康唑对照品 (a)和伏立康唑纳米结晶混悬液 (b)色谱图

2.3 线性试验

精密称定伏立康唑对照品适量，采用流动相溶解并稀释至刻度配制成浓度为10mg/ml的对照品贮备液。精密量取对照品贮备 液 2.5、5、10、20、50、100、200、300μl 于10ml量瓶中，加流动相稀释至刻度，按“2.1”项下色谱条件进样。以伏立康唑峰面积(A)对其浓度(C)进行线性回归，得回归方程:A=0.3289C+0.3699，R2=0.9998，线性范围为2.5 ～200μg/ml。

2.4 干扰试验

为了考察纳米结晶混悬液中辅料是否干扰伏立康唑的测定，取空白纳米结晶混悬液适量加流动相稀释至一定浓度，按“2.1”项下色谱条件进样，色谱图结果显示纳米结晶混悬液中辅料对样品中伏立康唑含量测定没有干扰。

2.5 精密度试验

精密吸取伏立康唑纳米结晶混悬液样品一定量，加流动相稀释20倍后，按“2.1”项下色谱条件连续进样5次，以伏立康唑峰面积计算，结果RSD为3.35%(n=5)。

2.6 稳定性试验

取浓度为200 μg/ml的伏立康唑对照品溶液按“2.1”项下色谱条件进样，1日内测定5次，以及每日测定1次，连续测定3d，得日内与日间RSD值分别为2.28%和5.57%(n=5)。

2.7 回收率试验

用流动相配制高、中、低三种浓度的伏立康唑对照品溶液，按“2.1”项下方法分别测定样品中伏立康唑的含量，每组浓度平行操作3次计算平均回收率 (表1)。从表1可知低、中、高浓度回收率分别为98.15%、104.41%和96.41%，RSD分别为0.45%、0.56%和0.32%。

2.8 样品含量测定

分别精密量取3个批号的伏立康唑纳米悬浮液0.2 ml(约相当于伏立康唑1 mg)，置于50 ml量瓶中加流动相稀释至刻度，摇匀作为供试品溶液。按“2.1”项下色谱条件进样，采用外标法计算样品中伏立康唑的含量，结果见表2。

表1 回收率试验结果

表2 伏立康唑纳米结晶混悬液含量测定

3 讨论

在专属性试验中，检出伏立康唑纳米结晶混悬液样品杂质对伏立康唑主成分峰的吸收没有干扰。从HPLC系列方法学研究可见，该HPLC法简便、快速、专属性强，可用于伏立康唑纳米结晶混悬液的含量测定。

［1］Shivaprakash MR，Apannanavar SB，Dhaliwal M，et al.Colletotrichum truncatum:an Unusual Pathogen Causing Keratitis and Endophthalmitis［J］.Clin Microbiol，2011，49(8):2894-2898.

［2］Hariprasad SM，Mieler WF，Lin TK，et al.Voriconazole in the treatment of fungal eye infections:a review of current literature［J］.Br J Ophtbalmol，2008，92:871-878.

［3］中华人民共和国药典委员会.中华人民共和国药典 (二部)［S］.北京:化学工业出版社，2010.

［4］姚毅，唐燕平.HPLC法测定注射用伏立康唑含量及有关物质［J］.药学进展，2005，29(12):562-565.

［5］糜志远，石磊，张迎庆.高效液相色谱法测定伏立康唑胶囊含量研究［J］.湖北工业大学学报，2011，26(5):47-49.