噬菌体法检测结核分枝杆菌及其耐药性的研究

张永胜 张松岩

我国是耐多药结核病患者人数最多的国家之一, 全国结核病耐药性基线调查报告显示, 我国结核分枝杆菌的初始耐药率为28.1%, 继发耐药率为41.1%, 耐多药结核病(MDR-TB)为8.32%［1］, 耐多药结核病的情况很严重, WHO已将我国作为全球25个耐多药结核病重点国家之一［2］。目前常规结核分枝杆菌药敏试验不能满足患者和临床需要。以噬菌体法进行结核分枝杆菌检测及药物敏感性试验, 在结核分枝杆菌检测和药敏应用研究备受关注。本研究利用噬菌体法对71株结核分枝杆菌临床分离株分别进行链霉素、利福平、异烟肼药物敏感性进行分析, 观察与比例法的符合率, 并对肺结核患者139份临床痰样本, 直接进行结核分枝杆菌检测应用研究。

1 材料与方法

1.1 样本来源 71株结核分枝杆菌临床分离株来自本所确诊的肺结核患者的痰样本培养物, 并经对硝基苯甲酸(PNB)鉴定为结核分枝杆菌；139份临床痰样本, 来自本所门诊临床确诊的肺结核患者。

1.2 方法

1.2.1 本用NaCl-NaOH去污染, 用15 ml PhageTek MB Medi Plus冲洗, 37℃过夜。(菌液不用去污染, 药敏试验加入相应药物, S、R孵育24 h, H孵育48 h, 药物终浓度分别为S 1 μg/ml、R 2 μg/ml、H 0.2 μg/ml)

1.2.2 感染噬菌体 向标本中加100 μl噬菌体, 37℃孵育1 h。

1.2.3 杀死结核(TB)体外游离的噬菌体 向标本中加100 μl强效病毒剂, 充分震荡, 静置5 min。

1.2.4 中和 向标本中加5 ml Medium plus , 片刻静置。

1.2.5 表达 向标本中加1 ml帮助细胞, 倒入瓶皿中, 加入5 ml融化的琼胶(不易过热50～60℃), 迅速旋转混匀, 静置,37℃过夜。

1.2.6 结果判定 0～19个菌斑 表明阴性结果, 说明标本中无活着的结核杆菌；20或更多菌斑 表明阳性结果, 说明标本中有活着的结核杆菌。药敏结果的判定：药敏培养基菌斑数<20或药敏培养基菌斑数/对照培养基菌斑数<1%, 判定为敏感；反之判定为耐药。

2 结果

2.1 应用 10例结核分支杆菌分别在 102、5×102、103、104、105cfu/ml浓度, (Mcfarland 3.0 浊度相当于细菌浓度107cfu/ml)进行噬菌体法检测结核菌。该方法检出最低浓度为 5×102cfu/ml。

2.2 噬菌体法结核分枝的特异性实验, 铜绿假单胞菌、肺炎双球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌等呼吸道常见细菌应用噬菌体法检测均为阴性。牛型分枝杆菌15株、结核分枝杆菌61株, 进行噬菌体法结核菌检测均为阳性。(菌液浓度均为105cFu/ml)其特异性达到100%。

2.3 噬菌体法进行药物耐药性分析, 见表1。噬菌体法药敏同比例法的符合率为90.2%, 分别为S 92.6%、 R 91.1%、H 88.6%。

表1 噬菌体法药敏与比例法药敏结果的比较(n, %)

2.4 肺结核患者临床痰标本139株, 直接进行噬菌体法结核菌检测。涂阳培阳标本该方法检出率为96.2%, 涂阴培阳标本检出率为80.0%, 涂阴培阴标本检出率为26.2%。见表2。

表2 139例肺结核患者临床痰标本的噬菌体法检测结果(n, %)

3 讨论

利用噬菌体法对结核分枝杆菌检测和药物敏感性实验具有较高敏感性和特异性, 菌液浓度达到5×102cFu/ml就可检测出来(涂片检出浓度为104cFu/ml), 特异性达到100%；其药物敏感性符合率较高(90.2%)；直接检测肺结核患者痰样本检出率为62.6%, 大大高出涂片30%的检出率；而药物敏感性结果报告时间(2～4 d)明显低于改良罗氏绝对浓度法的时间(2～3个月)。由上述研究结果可看出, 该方法是一种较理想、快速、具有较高敏感性和特异性检测结核分枝杆菌和药物敏感性新方法。

结核病细菌学快速检查历来是国内外学者所关注的热门话题。在国外以分支杆菌噬菌体为基础的结核分支杆菌的分类学、结核杆菌分子生物学、结核病诊断耐药性分析和新药筛选等已成为研究热点［3］。其敏感性可与聚合酶链反应(PCR)媲美, 而且与培养法符率高。国内多家单位也相继报道了噬菌体法检测抗结核药物药敏的结果, 均显示了较好的应用前景［4］。本实验应用噬菌体法对链霉素、利福平、异烟肼进行药物耐药性分析。噬菌体法药敏同比例法的符合率为90.2%,分别为S 92.6%、 R 91.1%、H 88.6%。与国内外报道基本相符。尽管噬菌体法检测结核分枝杆菌和药物敏感性实验具有快速、敏感、特异等优点, 但广泛应用于临床, 还需在统一操作方法、权威性的结果判定标准、商品化试剂盒等方面进行进一步研究。

［1］ 陈影.噬菌体法检测痰标本结核分枝杆菌及其耐药性的研究,延边大学, 2011.

［2］ World Health Organization.The Global MDR-TB ＆ XDR-TB Response Plan(2007-2008).Geneva:WHO, 2007:18.

［3］ 林健雄, 王冬敏, 彭东东, 等.噬菌体生物扩增法快速测定结核分枝杆菌卷曲霉素耐药性的研究.中国防痨杂志, 2008,30(6):506-509.

［4］ 边泽源, 何川, 涂少华, 等.噬菌体法直接检测痰标本中结核分枝杆菌利福平耐药性的研究.实验与检验医学, 2009, 27(6):145-146.