酪氨酸激酶受体、多药耐药基因1蛋白和增殖细胞核抗原在小鼠心脏不同部位的表达

李红军 李勇莉 刘 栋 王杰玉 李晋雪 王国栋 高福莲

(新乡医学院第一附属医院心内科，河南 新乡 453003)

哺乳动物的心脏有内在修复和再生的潜力〔1〕，无论在正常还是病理情况下均有心肌细胞处于分裂周期。心肌干细胞(CSCs)是多能干细胞，存在于成体心脏的、具有高度自我更新和特异性心肌分化、增殖能力的未分化细胞，具有酪氨酸激酶受体(c-Kit)、多药耐药基因1蛋白(MDR1)和干细胞抗原(Sca-1)等多能干细胞的表面标志，谱系标记物阴性。有研究证实经静脉注射有些细胞因子于急性心肌梗死的小鼠后，CSCs在外周血和心肌梗死区增多，参与心肌修复〔2〕，应用CSCs治疗心肌梗死成为心血管病领域的研究热点〔3〕。本研究通过检测小鼠成体固有心房、心耳、左心室、右心室和室间隔c-Kit、MDR1、增殖细胞核抗原(PCNA)的表达，探讨这些部位的c-Kit、MDR1、PCNA的表达有无差异。

1 材料和方法

1.1实验动物 近交系BALB/C 6只，雌性，体重38～40 g，来源于国家啮齿类实验动物种子中心上海分中心，SPF级。

1.2主要试剂与仪器 兔抗人c-Kit多克隆抗体、鼠抗人PCNA单克隆抗体、即用型SABC免疫组化染色试剂盒和DAB显色试剂盒均购自武汉Boster公司，多聚赖氨酸购自北京中杉金桥生物技术有限公司，兔抗人MDR1多克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，BH2直立光照照相系统由日本Olympus公司提供，HPIAS-10009增强型病理图文分析系统购自郑州太阳电子科技公司。

1.3实验方法

1.3.1石蜡切片的制作 速眠新(0.5 ml/kg)腹腔注射麻醉小鼠，开胸摘除心脏，从房室交界切开将心脏分为心室和心房2部分。4%多聚甲醛4℃固定48 h，常规脱水、透明、石蜡包埋，包埋面为房室交界切面。切片时心室修材到可见左右室和室间隔、心房可见心耳和固有心房，切片厚度6 μm，相邻切片分别贴于蛋白甘油黏附和多聚赖氨酸涂布的载玻片上，贴于蛋白甘油黏附的切片，进行HE染色，光学显微镜下观察形态。

1.3.2免疫组化染色 贴于多聚赖氨酸的切片脱蜡至水，按试剂盒说明操作。一抗为兔抗人c-Kit多克隆抗体(1∶100)、兔抗人MDR1多克隆抗体(1∶50)或鼠抗人PCNA单克隆抗体(1∶200)。兔抗人c-Kit多克隆抗体和兔抗人MDR1多克隆抗体的二抗为生物素化山羊抗兔工作液，鼠抗人PCNA单克隆抗体为生物素化山羊抗鼠IgG。DAB显色，苏木素复染。

1.4图像分析 采用郑州太阳电子科技公司的HPIAS-10009增强型病理图文分析系统进行图像分析，对每只小鼠心脏的每种免疫组化染色标本的固有心房、心耳、左心室、右心室和室间隔均采集5个高倍(×400)视野，用阳性区平均灰度值作为c-Kit、MDR1、PCNA表达的量。平均灰度值与表达强度一致。

1.5统计学处理 采用SPSS17.0软件进行单因素方差分析和SNK-q检验。

2 结 果

2.1c-Kit在小鼠心脏的表达 c-Kit阳性呈黄色或棕黄色颗粒，主要定位于细胞膜上，心肌细胞居多。c-Kit在小鼠固有心房、心耳、室间隔、左心室和右心室的表达水平有差异，由高到低依次为左心室、心耳、室间隔、固有心房和右心室(P<0.01)。见表1及图1。

表1 小鼠心脏不同部位c-Kit、MDR1和PCNA的表达±s，n=6)

2.2MDR1在小鼠心脏的表达 MDR1免疫组化阳性信号主要定位于细胞膜上，呈棕黄色颗粒弥漫分布，心肌细胞较多，MDR1在小鼠固有心房、心耳、室间隔、左心室和右心室的表达水平有统计学差异，MDR1表达由高到低依次为心耳、右心室、左心室、固有心房和室间隔(P<0.05)，见表1，图1。

2.3PCNA在小鼠心脏组织中的表达 PCNA免疫组化阳性信号主要定位于细胞核上，呈棕黄色或深棕色分布，主要存在于心肌细胞间结缔组织的细胞中。固有心房与室间隔、固有心房与左心室、空间隔与左心室、心耳与右心室之间PCNA表达灰度值的差异无统计学意义(P>0.05)，在固有心房、室间隔和左心室的表达较高，心耳与右心室的表达较低(P<0.05)，见图1和表1。

c-Kit MDR1 PCNA

3 讨 论

c-Kit由跨膜c-Kit原癌基因编码，同血小板衍生的生长因子和集落刺激因子-1属于同一受体家族。c-Kit是经典的干细胞标记之一，胚胎大鼠〔4〕、新生大鼠〔5〕等心肌分离的具有自我更新能力并能分化成心肌细胞、内皮细胞及平滑肌细胞的细胞均为c-Kit阳性，心梗小鼠心c-Kit阳性细胞可以增生、迁移向缺血区并分化为心肌和血管〔6〕。在犬的心脏，c-Kit阳性的CSCs分化为心肌细胞的数量分别是MDR1阳性的2.3倍〔7〕。c-Kit促进CSCs的向心肌分化直至终末分化〔8〕。Ayach等〔9〕发现c-Kit信号在预防心室扩大和肥大中有重要作用。由血管紧张素Ⅱ受体〔10〕、雌激素α受体〔11〕介导的心脏保护也是通过c-Kit阳性细胞实现的。在大鼠抗高血糖诱发的心脏的氧化应激过程中，c-Kit阳性细胞参与其中，表现为左心室c-Kit阳性细胞数量增加和增殖速度加快而心房的c-Kit阳性细胞数量减少〔12〕。培养早期的CSCs可以表达包括c-Kit和Sca-1等多种表面标记物，随着细胞的成熟有些表面标记物逐渐消失，但c-Kit不随细胞生长成熟而消失。

研究显示c-Kit阳性细胞在人心脏的不同部位有差别，Pouly等〔13〕对心脏移植受体患者的心内膜及右心耳的活检组织用免疫组化的方法观察发现心内膜的c-Kit阳性细胞明显比右心耳多(P=0.01)；Itzhaki-Alfia等〔14〕对人心脏或心脏活检标本用细胞培养和流式细胞仪分选的方法研究发现c-Kit阳性细胞数量由高到低依次为右房、左心室、左房及右心室，女性的c-Kit阳性细胞较多。本研究结果提示心脏各部位c-Kit的表达不同在人和鼠相似，在心脏各部位c-Kit阳性高低的排序在人和鼠的不同可能因素有观察个体的生理病理状态、检测方法和人和鼠的种属差异等。

MDR1存在于细胞膜，为能量依赖性的外排泵，Sellers等〔15〕人证实在恒河猴心脏内分离出的干细胞表面可表达MDR1阳性，Quaini等〔16〕得出人心脏有可能存在着CSCs的研究结果显示具有干细胞表面相关抗原特征的原始细胞表现为MDR1阳性，Dergilev等〔17〕报道心室壁瘤的瘤壁全层都有c-Kit和MDR1共表达细胞，Beltrami等〔18〕从大鼠心肌内分离出的原始细胞c-Kit和MDR1同时阳性并能分化成心肌细胞。尽管在人〔19〕和大鼠心脏的原始细胞均发现有c-Kit和MDR1共表达现象，但对犬的心脏观察发现c-Kit阳性、MDR1阳性或Sca-1阳性的CSCs占5%，60%以上的CSCs表达3种抗原，约8%表达2种抗原〔7〕。本实验提示c-Kit和MDR1在小鼠心脏各部位的表达和犬相似有不一致性。

研究发现人未成熟心肌和晚期衰竭心肌PCNA有表达，陈旧性心肌梗死区的心肌细胞和新生细胞也有PCNA表达〔20〕，扩张型心肌病晚期患者的心肌组织PCNA的表达率与存活时间呈正相关〔21〕，克氏锥虫感染性心肌炎的炎性部位PCNA的阳性表达增高〔22〕；大鼠心梗死者的心梗区组织也有些细胞PCNA阳性〔23〕，这些研究涉及未成熟心肌和心肌损伤修复，几乎没有涉及PCNA在正常成年的心肌组织表达。本实验结果提示在正常状态下，心肌细胞增殖活性很低，但间质细胞增殖活性较高；PCNA在固有心房、室间隔和左心室的表达较高，心耳与右心室的表达较低，可能与功能活动有关。

4 参考文献

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