血管内皮生长因子对毛乳头细胞生长特性的影响

张国强 李 玲 程 毅 高顺强

(河北医科大学第四医院皮肤科，河北 石家庄 050011)

毛乳头细胞是位于毛囊基底部的一群真皮源性细胞，其显著的生物学特性为体内外表现为凝集性的生长方式及体内外具有诱导毛囊形成的能力。研究表明毛乳头细胞分泌的多种生长因子如胰岛素样生长因子1(IGF-1)，成纤维细胞生长因子7 (FGF7)及干细胞因子(SCF)等均可以促进体外培养的人毛乳头细胞的增殖〔1，2〕。血管内皮生长因子(VEGF)即血管渗透因子或血管调理素。它是毛乳头自分泌的一种生长因子并可作用于毛乳头细胞。VEGF的生物学功能一是增加血管的通透性，二是刺激血管生成〔3，4〕。本实验旨在观察不同代次毛乳头细胞表达VEGF的情况，并通过人工干预的方法加入VEGF观察其对毛乳头细胞生长曲线的影响。

1 材料和方法

1.1设计 细胞对比观察实验。时间及地点：实验于2009年5月至2010年12月在河北医科大学第四医院科研中心及河北医科大学第一医院耳鼻喉科实验室完成。

1.2材料 头皮取自2009～2010年河北医科大学第四医院神经外科手术患者，年龄20～40岁，无系统性疾病，均取得患者同意，离体6 h进行实验。

1.3试剂 分离酶、胶原酶D、L-谷氨酰胺、四甲基偶氮唑盐(MTT)、二甲基亚砜购于美国Sigma公司，鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白单克隆抗体购于美国Neomarker公司，胎牛血清购于杭州四季青生物材料有限公司，重组人VEGF、DMEM培养基购于美国Gibco公司，VEGF单克隆抗体购于北京中杉金桥生物有限公司。

1.4毛乳头细胞的分离培养 人毛乳头细胞采用两步酶消化分离法分离〔5〕，得到纯化的人毛乳头细胞加入含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基混匀后，以每培养瓶30～50个毛乳头的密度接种。待毛乳头贴壁后换液，去除未贴壁的单个细胞及杂质。分离出的毛乳头3 d后90%贴壁，贴壁1 d后可观察到细胞迁出呈放射状生长，通过α-平滑肌肌动蛋白染色、甲苯胺蓝染色、PAS染色鉴定为毛乳头细胞。2～3 w后细胞大部分生长融合。6代之前细胞可见凝集性生长，随细胞传代次数增加该特性逐渐消失。免疫组织化学染色检测血管内皮生长因子表达：分别取凝集性生长的第3代、第6代和非凝集性生长的第9代毛乳头细胞，0.25%胰酶消化后接种至放有盖玻片的6孔板中，体积分数5%CO2温箱37℃孵育24 h，收取盖玻片，40 g/L多聚甲醛固定15 min，4 ℃过夜。以鼠抗人VEGF单克隆抗体作一抗对3个代次的毛乳头细胞进行染色，按SP法介绍的步骤进行〔6〕。以PBS代替一抗作阴性对照。

1.5流式细胞仪检测VEGF表达 取第3，6，9代毛乳头细胞，洗涤后调整毛乳头细胞浓度为1×109/L，分别加入兔抗人VEGF单克隆抗体工作液，室温避光反应2 h，PBS液洗涤后，加入二抗工作液100 μl，孵育30 min，PBS洗涤，上流式细胞仪检测。结果分析：生长因子表达量用均道值表示。

1.6MTT法检测血管内皮生长因子对毛乳头细胞生长的影响 取对数生长期的第3代人毛乳头细胞，调整细胞浓度为1×107/L，按每孔200 μl加入96孔板中，将实验分为20 μg/L的VEGF组及只加培养基的空白对照组。每组设7个时相点，每个时相点设3个复孔。隔日检测1次。于各时相点时前4 h，每孔加入20 μl MTT(5 g/L)，继续培养4 h，吸取上清液，弃之，过每管加入二甲基亚砜150 μg，避光条件下振荡10～15 min，用全自动酶标仪于波长492 nm处测定各孔吸光度值，所有实验重复3次，记录结果。

1.7主要观察指标 免疫组织化学法和流式细胞仪测定第3，6，9代人毛乳头细胞中VEGF的表达。MTT法测定VEGF对人毛乳头细胞的增殖作用。

1.8统计学分析 采用SPSS13.0软件进行方差分析。

2 结 果

2.1毛乳头细胞中VEGF的表达 VEGF表达于细胞胞质，着色由黄色到褐色不等。胞质出现黄色颗粒为(+)，棕色颗粒为()，褐色颗粒为()。第3，6，9代毛乳头细胞免疫组织化学染色后VEGF表达分别为、和+。VEGF随着毛乳头细胞代次的增多，表达逐渐减弱，空白对照为阴性。见图1。

2.2流式细胞仪检测结果 第3，6，9代毛乳头细胞VEGF的均道值分别为312.94±7.98，269.62±31.42，180.16±15.40，经统计学分析，两两相比差异显著(F=21.42,P=0.002)。

第3代

第6代

第9代

2.3MTT法检测VEGF对毛乳头细胞生长的影响 根据MTT测得的A值，可见两组细胞的停滞期不尽相同，3代细胞的VEGF组为2 d，而空白对照组为4 d，随后进入对数生长期。并且VEGF组在10 d后与已经进入缓慢生长期的空白对照组相比仍然保持着良好的生长状态。通过比较各组细胞的吸光度(A)值发现3代细胞体外培养4 d后VEGF组较空白对照组明显升高。随着培养时间的延长，VEGF组的A值与空白对照组相比明显升高，A值在一定范围内可以反映细胞数，故VEGF可以促进毛乳头细胞的增殖。见表1。

表1 血管内皮生长因子对毛乳头细胞的吸光度值的影响±s)

3 讨 论

VEGF和毛囊生物学有着密切的关系，很多学者在这方面进行了研究。Lachgar等〔7〕通过免疫组织化学的方法发现体外培养的大鼠触须毛囊的毛乳头细胞在生长期抗VEGF染色阳性，体外培养的毛乳头细胞胞质中抗VEGF染色亦阳性。进一步研究证明了VEGF能特异性地结合培养的鼠触须毛乳头细胞，并促进其增殖和迁移，其促进毛乳头细胞增殖的最大效应为碱性成纤维细胞生长因子的一半，而对迁移的影响为碱性成纤维细胞生长因子的3倍，应用抗VEGF的中和性抗体可以阻断重组VEGF和毛乳头起源的VEGF的活性，从而首次证实VEGF是毛乳头细胞的一种自分泌生长因子。Kozlowska等〔8〕采用RT-PCR和Northern印迹法证明培养的毛乳头细胞可以分泌VEGF121、VEGF145、VEGF165和VEGF189，4种形式的VEGF mRNA，其中以VEGF121含量最高，而VEGF189含量最低，进一步利用放射免疫沉淀法证明毛乳头细胞提取物和培养的上清中有VEGF蛋白的表达，还通过免疫组织化学证明毛乳头细胞胞浆抗VEGF染色亦阳性。临床上促进毛发生长的药物如：米诺地尔，拉坦前列素及各种中药都促进毛乳头细胞合成和分泌VEGF，并且分泌VEGF的量和药物浓度有剂量依赖关系〔9～11〕。反之斑秃患者的毛乳头细胞VEGF表达减弱或消失。而雄激素性脱发患者脱发区与非脱发区毛乳头的体外培养结果显示，脱发区毛乳头体积较小，毛乳头细胞生长缓慢，毛乳头细胞分泌VEGF的量减少，而细胞形态和凝集性生长无明显变化〔11〕。可见毛乳头细胞分泌VEGF障碍与毛发疾病有相关性。

郭晓静等〔12〕也证明体外培养的毛乳头细胞能够合成与分泌VEGF，VEGF表达胞质内，并随着体外培养的毛乳头细胞传代次数的增多，VEGF的表达逐渐减弱。本实验结果显示，随着体外培养的毛乳头细胞传代次数的增加VEGF表达减弱，VEGF可以缩短毛乳头细胞生长曲线的停滞期，提早进入对数生长期，并且延迟进入平台期的时间。VEGF是毛乳头细胞的自分泌因子，当毛乳头细胞的合成分泌功能降低时，其生长增殖功能以降低。VEGF对细胞增殖有明显促进作用，但其具体作用机制还有待继续研究。

4 参考文献

1张国强， 李 玲， 程 毅，等.干细胞因子对体外培养毛乳头细胞生长特性的影响〔J〕.中国皮肤性病学杂志，2010；24(11): 1000-2.

2张国强，程 毅，李 玲，等.胰岛素样生长因子-1和成纤维细胞生长因子7与毛乳头细胞的生长〔J〕.中国组织工程与临床康复杂志，2010；14(50): 9346-8.

3Kajdaniuk D,Marek B,Foltyn W,etal.Vascular endothelial growth factor (VEGF) -part 1: in physiology and pathophysiology〔J〕.Endokrynol Pol,2011；62(5): 444-55.

4罗美蓉，王正伟，安志星.人血管内皮生长因子研究进展〔J〕.中国老年学杂志，2012；32(17): 3835-7.

5程 波，刘荣卿，伍津津，等.改良毛乳头细胞培养法〔J〕.中华皮肤科杂志，2001；34(5): 387-8.

6Randall VA,Hibbrts NA,Hamada K,etal.A comparison of the cultured and growth of dermal papilla cells derived from normal and balding〔J〕.Br J Dermatol,1996;134(3): 437-44.

7Lachgar S,Moukadiri H,Jonca F,etal.Vascular endothelial growth factor is an autocrine growth factor for hair dermal papilla cells〔J〕.J Invest Dermatol,1996;106(1):17-23.

8Kozlowska U,Blume-Peytavi U,Kodelja V,etal.Expression of vascular endothelial growth factor (VEGF) in various compartments of the human hair follicle〔J〕.Arch Dermatol Res,1998;290(12): 661-8.

9Han JH,Kwon OS,Chung JH,etal.Effect of minoxidil on proliferation and apoptosis in dermal papilla cells of human hair follicle〔J〕.J Dermatol Sci,2004;34(2): 91- 8.

10关宁宁，陈蕾，孙蔚凌，等.精氨酸对人毛乳头细胞增殖的影响〔J〕.临床皮肤科杂志，2011；40(6)：335-9.

11陈 蕾，关宁宁，孙蔚凌，等.咖啡因对体外培养人毛囊及毛乳头细胞的影响〔J〕.临床皮肤科杂志，2011；40(6)：323-7.

12郭晓静，郝 飞，姜晓勇，等.人毛乳头细胞在不同传代时期某些细胞因子表达的变化〔J〕.第三军医大学学报，2006；28(21)：2144-5.