自体DC-CIK细胞联合替吉奥治疗中晚期肝癌的疗效

梁倩影 刘先领

(中南大学湘雅二医院肿瘤科，湖南 长沙 410000)

尽管外科手术水平和肝癌移植技术已经取得了巨大的进步，但由于肝癌起病隐匿，侵袭生长迅速，80%以上的肝癌患者在确诊时已存在肝癌播散、远处转移、门脉癌栓或伴有严重的肝硬化，不能进行手术。包括全身化疗在内的非手术疗法仍不失为延长生存、提高生活质量的重要方法〔1〕。随着替吉奥、卡培他滨等新型化学治疗药物的问世，口服单药化疗逐渐成为临床上采用的姑息性治疗方法〔2〕。肿瘤生物免疫治疗作为一种新兴的治疗手段成为近年来肿瘤治疗领域关注的热点问题。树突细胞(DC)是目前已知体内功能最强的抗原提呈细胞。细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)是一种在体外经细胞因子诱导、增殖而得的具有抗瘤谱广、杀瘤活性高的特性的免疫活性细胞。本研究采用DC-CIK自体免疫细胞联合替吉奥治疗中晚期肝癌患者，分析疗效。

1 资料与方法

1.1入选标准 (1)经影像学或病理活检确诊的中晚期肝癌患者，无法行手术治疗，不适合或不考虑行肝动脉栓塞化疗者；(2)患者自愿接受上述治疗并签署同意书 ；(3)肝功能Child-Pugh分级为A或B患者；(4) 各项常规、生化检查指标无相关禁忌证；(5)Kamofsky评分≥60，无严重的心、肺、肾功能障碍及全身恶液质情况；(6)预计生存期>3个月；(7)无明显感染，无精神类疾病。

1.2研究对象 我科2011年1月至2013年5月经检查确诊为中晚期肝癌的患者48例，男34例，女14例，年龄31～72(平均48.6)岁，经影像学或病理活检确诊但无法行手术治疗，不适合或不同意行肝动脉栓塞化疗者。巨块型肝癌26例，多发结节型肝癌22例，其中外科手术失败或术后复发患者9例。患者肝内病灶2 cm×3 cm～13.0 cm×15.1 cm，含肝硬化、门静脉及下腔静脉癌栓、腹腔积液、黄疸、远处转移者。28例有原发病或(和)转移瘤的病理学或组织细胞学证据，所有病例均有相应的影像学资料，有可见原发灶或(和)转移病灶可供评估疗效。

1.3治疗方法 所有入组病例均先行外周血单核细胞采集，标本送实验室行DC-CIK细胞培养及扩增，后开始口服替吉奥治疗，细胞培养完成后安排自体DC-CIK细胞输注治疗。12 w为1个疗程，如无明显不良反应则重复疗程。治疗期间每周查血常规1次，每2 w查肝功能1次，白细胞计数<3×109/L或肝功能异常时停药2 w后进行评价，对药物反应性好及可耐受治疗者停药2～4 w后可继续治疗。

1.3.1替吉奥(S-1)治疗 根据体表面积来确定初始剂量，体表面积<1.25 m2，S-1 40 mg/次，2次/d；体表面积1.25～1.5 m2，S-1 50 mg/次，2次/d；体表面积>1.5 m2，S-1 60 mg/次，2次/d，早饭后和晚饭后分别口服1次，连续服用28 d(4 w)，停药14 d(2 w)。12 w为1个疗程。

1.3.2DC-CIK治疗 (1)细胞分离：经CS-3000血细胞分离机采集患者外周血5L中的新鲜抗凝外周血单核细胞，再用聚蔗糖400(Ficoll 400)分离后经Hank液洗3次，收集纯度在90%以上的外周血单个核细胞(PBMNC)。

(2)CIK体外培养和扩增：将PBMNC加入到含1 000 U/ml 干扰素(IFN)-γ和自体血清的完全培养基中，调整细胞浓度至2.0×106个/ml，24 h后加入白细胞介素(IL-2) 1 000 U/ml和CD3单抗0.5 μg/ml，后根据CIK生长情况每隔2～3 d适时补充培养基和IL-2，置于37℃，5%CO2培养箱中培养10～14 d后。2次/w测定白细胞增殖率和CD3、CD56阳性细胞率，当细胞数扩增达到设计目标，阳性目标细胞达到85%时，离心收集细胞，同时取样做质量检控(参照柯莱逊《质量检控标准》CLS-T-W-009)。将合格的CIK分4次静脉回输至患者体内，单次回输CIK数目不少于1.0×109个。

(3)DC体外培养和扩增：将CS-3000分离得到的PBMNC用无血清1640培养液重悬，浓度为2×106/ml铺入6孔板，孵育2 h后弃上清，获得贴壁单核细胞，加入DC完全培养基(含GM-CSF 100 ng/ml和IL-4 500 U/ml)，置于37℃、5%CO2培养箱中；培养第5天加入肿瘤坏死因子(TNF)-α诱导DC成熟，第7～8天收集悬浮的DC，同时取样做质量检控(参照柯莱逊《质量检控标准》CLS-T-W-009)。将合格的DC分4次静脉回输至患者体内，单次回输DC数目不少于1.0×107个。

(4)细胞回输方案：患者一般状况良好，细胞培养成熟后开始交替回输CIK和DC，2～3次/w，一次回输CIK不少于1×109个，DC不少于1×107个。

(5)外周血免疫功能检测：细胞治疗前及治疗完成4 w后检测患者外周血T淋巴细胞亚群(CD3+、CD4+、CD16+CD56+、CD4+/CD8+)变化。

1.4观察及疗效评估 观察指标包括治疗前后瘤体变化、外周血免疫指标、肿瘤标志物、症状改变、生活质量及不良反应等。疗效评估采用美国癌症研究所制定的实体肿瘤RESIST疗效评估方法,将疗效分为完全缓解(CR)、部分缓解(PR)、稳定(SD)、进展(PD)，总有效率(RR)=CR+PR，疾病控制率(DCR)=CR+PR+SD〔5〕。记录患者治疗前后食欲、睡眠、精神、体力等情况，用 Karnofsky 计分法(KPS)判断治疗前及治疗后生活质量的改善情况，凡在治疗后较治疗开始前计分提高10分以上者为改善，下降10分以上者为恶化，提高或下降10分者为稳定，总提高率=(改善+稳定)×100%。不良反应按WHO抗肿瘤药物不良反应的分度标准，分为0～Ⅳ度〔5〕。

1.5统计学方法 应用SPSS17.0软件进行配对t检验。

2 结 果

2.1瘤体变化 48例中晚期肝癌病例均有可测量病灶，经DC-CIK联合替吉奥治疗1个周期(12 w)后，采用彩超、CT、MRI等影像学检查方法测量病灶大小，按RESIST实体瘤的近期疗效标准，其中CR 0例，PR 10例，SD 22例，PD 16例，总有效率(RR)为20.8%，疾病控制率(DCR)为66.7%。

2.2外周血免疫指标变化 治疗后外周血CD3+、CD4+百分率，CD4+/CD8+比值明显上升(P<0.05)；NK细胞(CD16+CD56+)比例较前上升，T毒性/抑制细胞(CD3+CD8+)较前下降，但差异不明显(P>0.05)。见表1。

表1 治疗前后免疫指标变化±s，n=48)

2.3临床症状缓解情况 48例中晚期肝癌患者经1个疗程(12 w)治疗后在乏力(32 vs 40例)、食欲不振(25 vs 32例)、疼痛(12例 vs 22例)腹水(16例 vs 28例)、黄疸(23 vs 34例)、腹胀(19例 vs 26例)等方面得到明显缓解。

2.4KPS评分变化情况 积极治疗后，大部分患者的KPS评分得到提高，平均提高10～20分，总提高率高达89.6%。 见表2。

表2 治疗前后患者KPS评分情况(n)

2.5毒副反应 主要的不良反应是中性粒细胞减少、消化道反应及皮肤色素沉着，其中Ⅰ度粒细胞减少者6例，Ⅱ度减少2例，无Ⅲ、Ⅳ度减少者，经粒细胞集落刺激因子(G-CSF)治疗后粒细胞计数恢复正常，不影响继续用药。6例患者出现恶心症状，2例患者出现短暂呕吐，48例患者均未出现Ⅲ度及以上消化道反应。3例患者治疗后出现丙氨酸氨基转移酶(ALT)轻度升高，加强护肝治疗后ALT恢复正常并完成治疗。4例患者回输DC-CIK细胞后出现发热，体温均低于38.6℃，持续时间2～6 h，有1例给予酚咖片处理外，其他3分自行缓解。

3 讨 论

替吉奥是一种氟尿嘧啶衍生物口服抗癌剂，是替加氟(FT)、吉美嘧啶(CDHP)和奥替拉西钾(Oxo)三种药物组成的复方制剂，与5-FU相比具有以下优势：①能维持较高的血药浓度并提高抗癌活性；②明显减少药毒性；③给药方便。替吉奥在胃癌上已显示较好的疗效,甚至可以与联合方案相媲美，在原发性肝癌的小样本研究中也显示出可喜的效果,且与5-FU不完全交叉耐药〔3〕。

乙型肝炎病毒慢性感染是我国肝癌的主要致病原因，患者体内存在不同程度的免疫功能缺陷。研究显示〔4〕，肝癌患者存在外周血 DC 成熟障碍，主要表现为循环 DC 低表达组织相溶性复合体(MHC-Ⅱ)和 白细胞介素(IL- 12)；摄取抗原颗粒以及同种 T 细胞刺激能力下降。本文应用的 DC 是经过体外活化和扩增，并经过肝癌组织特异性抗原(AFP)刺激的成熟 DC，国外实验证明, 用 AFP 致敏的DC可抑制肝细胞癌的生长, 且对正常肝细胞的再生没有影响〔5〕。本文应用的 CIK 细胞是将人外周血单个核细胞在体外用多种细胞因子(如抗 CD3McAb、IL-2、IFN-γ等) 共同培养一段时间后获得的一群高数量细胞群，单个疗程可达 1×109个，CIK兼具有淋巴细胞强大的杀瘤活性和自然杀伤(NK)细胞的非主要MHC-Ⅱ限制性杀瘤特点，它是迄今发现的所有免疫效应细胞中增殖能力最强、细胞毒活性较强的细胞。DC和CIK细胞是肿瘤免疫治疗的两个重要部分，二者联合可以有效提高机体的免疫功能，改善生存质量，延长生存期，同时增加化疗敏感性，降低化疗不良反应。以往认为化疗主要对机体产生免疫抑制的负面影响。然而，近几年来借助新的研究技术和较理想的动物模型，对化疗和免疫反应的相互作用有了更深入的了解，认为化疗对肿瘤的免疫功能存在双重的影响。替吉奥为氟尿嘧啶类的氟化物，通过在体内转化为5-FU，可作为一种免疫调节剂。5-FU通过诱导肿瘤细胞的抗原及MHC分子的表达，从而恢复细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对靶细胞的特异性杀伤活性。通过选择性清除髓系来源抑制细胞(MDSCs)，提高后续免疫治疗的疗效〔6〕。本研究发现，DC-CIK能够增强机体的细胞免疫功能，改善机体的免疫抑制状态，这与文献报道一致〔7〕。

综上所述，自体免疫细胞DC-CIK联合替吉奥治疗中晚期肝癌，具有较好的抗肿瘤作用及轻微的毒副反应，改善患者生活质量，安全性高，是中晚期肝癌治疗的新选择。

4 参考文献

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3Moirse Z,Sugioka A,Fujita J,etal.S-1plus cisplatin combination therapy for the patients with primary liver carcinomas〔J〕.Hepatogastroenterology,2007; 54(80):2315-8.

4Eli Gilboa. DC-based cancer vaccines 〔J〕. J Clin Invest, 2007;117(5):1195-203.

5Hanker P,Serwe M,Dombrowski F,etal. DNA vaccination with AFP- encoding plasmid DNA prevent s growth of subcutaneous AFP-ex-pressing tumors and does not interfere with liver re-generation in mice〔J〕.Cancer Gene Ther,2002;9(4):346-55.

6Vincent J,Mignot G,Chalmin F,etal.5-Fluorouracil selectively kills tumor-associated myeloid-derived suppressor cells resulting in enhanced T cell-dependent antitumor immunity〔J〕.Cancer Res,2010;70(8):3052-61.

7王广伟,顾元龙,刘敏丰.负载自身肿瘤裂解物的树突状细胞联合杀伤细胞对肝癌患者术后免疫功能的影响〔J〕.中华普通外科杂志,2012;27(4):337-8.