四种抗癌药物对乳腺癌MDA-MB-435细胞的体外抗肿瘤活性

黄银久 胡小梅 唐 洁 刘 浩 丁一博 何鮦鮦 刘培培 王雪粉

(蚌埠医学院生物科学系，安徽 蚌埠 233030)

乳腺癌早期发现和早期诊断是提高乳腺癌疗效的关键。医学上往往根据肿瘤分期对已发乳腺癌患者采取综合治疗的方案〔1〕。对于中晚期乳腺癌转移扩散患者往往采取手术后放化疗的手段，其中以表柔比星为代表的蒽环类单药或联合化疗方案和紫杉醇(Taxol)为代表的紫衫类单药或联合化疗方案为主〔2,3〕。本文以高转移性人乳腺癌细胞系MDA-MB-435为研究对象，从疗效和毒性等方面评价表柔比星、紫杉醇、奥沙利铂、羟喜树碱的体外抗癌活性。

1 材料和方法

1.1细胞系和试剂 MDA-MB-435细胞由陈超老师馈赠(蚌埠医学院药学系)；DMEM 培养基(GIBICO)；胎牛血清 (杭州四季青生物工程材料有限公司)；MTT,Trypsine (SIGMA)；乳酸脱氢酶试剂盒(LDH)(南京建成生物工程研究所)；表柔比星(浙江海正药业股份有限公司)；紫杉醇( 深圳万乐药业有限公司)；奥沙利铂(江苏恒瑞医药股份有限公司)；羟喜树碱(黄石飞云制药有限公司)。

1.2细胞培养和药物作用 MDA-MB-435细胞在含10%胎牛血清(FBS)的DMEM培养基、37℃、5%CO2的饱和湿度培养箱中培养，2 d换一次培养液，4～6 d传代一次，取对数生长期细胞为实验对象。实验药物以生理盐水为溶剂，配成40 mmol/L作为储备液，在使用前，直接用培养基将其稀释到作用浓度，生理盐水作为对照组。

1.3方法 取对数生长期细胞，用0.025%胰蛋白酶常规消化后，重悬于含10% FBS的DMEM培养基中，细胞种在96孔培养板中，每孔100 μl细胞悬液含 3.5×104个细胞， 最右一排孔为空白对照组，加同体积完全培养基。置于5% CO2、37℃的饱和湿度培养箱中培养24 h细胞贴壁。去除培养基，加入含不同药物的完全培养基，每孔200 μl，空白对照组每孔加200 μl完全培养基。利用MTT比色法，在A595波长下测OD值，计算抑制率，计算公式：

抑制率(%)=(1-药物处理OD值/阴性对照组OD值)×100%。同样处理细胞，阴性对照组培养基中加等体积的生理盐水，分别处理12、24、36、48、60、72 h后，用倒置显微镜观察药物对细胞的形态学影响并拍照。同样处理细胞，阴性对照组加生理盐水。处理72 h，去除上清，每孔加100 μl的 0.5 mg/ml的MTT(溶解在1×PBS)，培养4.5 h后用倒置显微镜观察甲瓒结晶生产情况。

1.4LDH活性测定 将正常培养的细胞以5×104cells/well的浓度接种到12孔板中，贴壁24 h后加药物处理，设空白对照组、实验组分为加药孔、完全释放孔(阳性对照组)、自然释放孔(阴性对照组)。自然释放孔和完全释放孔分别加和药物同体积的生理盐水，作用24 h后，完全释放孔加2% Triton X-100完全裂解细胞作为阳性对照。按照LDH试剂盒操作说明进行操作和计算。

1.5统计学方法 利用SPSS11.5软件运用One-Way ANOVA方法分析。

2 结 果

2.1四种抗肿瘤药物的体外抗肿瘤效果 紫抗醇无论在1 μmol/L或者10 μmol/L浓度下对靶标细胞都有较好的体外抑制活性，而表柔比星在1 μmol/L浓度下的抑制活性相对较低；与这两个药物相比， 奥沙利铂的效果稍差， 而羟喜树碱却显示出非常好的抑制活性，见表 1。

表1 四种药物在 1 μmol/L 和10 μmol/L浓度下对MDA-MB-435细胞的体外抑制活性±s)

2.2四种化疗药物对MDA-MB-435细胞产生了不同的形态学影响 与生理盐水对照组相比，表柔比星在1 μmol/L下，随着作用时间延长细胞增殖减弱，同时细胞开始变形增大，在10 μmol/L浓度下对细胞作用36 h细胞裂解；而紫杉醇作用更加明显，在1 μmol/L或10 μmol/L浓度下，作用细胞12 h，细胞皱缩变小；与表柔比星作用很相似，羟喜树碱在1 μmol/L或10 μmol/L作用细胞24 h，细胞皱缩变小；与以上三个药物不同，奥协利铂无论在1 μmol/L或10 μmol/L作用细胞12～72 h，主要导致细胞增殖减弱，10 μmol/L浓度尤为明显，见图1。

图1 四种药物对MDA-MB-435细胞的形态学影响

2.3甲瓒结晶生成结果 图2表明，与生理盐水对照相比，表柔比星在10 μmol/L浓度下对靶标细胞作用72 h，细胞基本完全死亡；而紫杉醇在1 μmol/L 或10 μmol/L浓度下细胞都基本死亡；与紫杉醇相似，羟基喜树碱在1 μmol/L 或10 μmol/L细胞基本完全死亡，但在相应浓度下毒性比Taxol轻；与以上三种化疗药物不同，奥沙利铂显示了很轻的细胞毒性。

图2 四种药物对MDA-MB-435细胞作用72 h后甲瓒结晶生成情况

2.4LDH活性检测结果 表柔比星在低浓度下对靶标细胞的毒性相对较小，在1～10 μmol/L下与阴性对照组相比P>0.05，与阳性对照组相比P<0.001；但是当浓度增大对细胞的毒性明显增大，在20～40 μmol/L下与阴性对照组相比P<0.001，与阳性对照组相比P<0.001；紫杉醇在所有的实验浓度下都显示出极大的细胞毒性，各浓度下与阴性对照组相比P<0.001，与阳性对照相比P>0.05或P<0.001。羟喜树碱显示了和紫杉醇极相似的细胞毒性。奥沙利铂在实验的各浓度下显示了很低的细胞毒性，在所有的检测浓度下和阴性对照组相比P>0.05，与阴性对照组相比P<0.002。

表2 四种药物对MDA-MB-435细胞作用24 h后细胞毒作用比较±s,υ/L)

3 讨 论

局部晚期乳腺癌发现时已非早期，蒽环类与紫杉类是其中最有效的两类药物〔4〕。表柔比星直接嵌入DNA碱基对之间，干扰转录过程，阻止mRNA的形成，从而抑制DNA和RNA的合成，为一细胞周期非特异性药物；紫杉醇作用机制主要体现在通过打破微管和微管蛋白二聚体之间存在动态平衡，破坏细胞有丝分裂时纺锤丝和纺锤体的形成，从而抑制细胞的分裂和增殖。以上的实验结果表明：紫杉醇的这种药理作用明显强于表柔比星的作用，由于考虑到这两种药物的作用机制不同，所以可以考虑把这两种药物联合使用，更大的发挥抗癌作用〔5,6〕。与这两种药相比，羟喜树碱和奥沙利铂在相应浓度下也具有很好的体外抑制活性。羟喜树碱主要作用于S期，为细胞周期特异性药物，对处于S期的细胞作用较G1期和G2期显著。由于细胞S期受到干扰，核分裂受到抑制，阻止细胞进入分裂期。结合上面的实验结果，不难看出这一作用机制对肿瘤细胞的作用是很强烈的。与以上三种抗癌药物相比，奥沙利铂在实验浓度下虽然显示了相对较小的抑制活性，但是同时也表现出相对较小的细胞毒作用。有关奥沙利铂的作用机制不完全清楚，它可以通过产生水化衍生物抑制DNA 的合成，产生细胞毒作用和抗肿瘤活性。但是本实验表明，奥沙利铂很明显的抑制了细胞的增殖，所以应该从抑制细胞增殖的途径对奥沙利铂展开更广泛和深入的研究。

4 参考文献

1Cheng YC,Ueno NT.Improvement of survival and prospect of cure in patients with metastatic breast cancer〔J〕.Breast Cancer,2012;19(3):191-9.

2熊 娟,徐笑红,陈文虎,等.p21在乳腺癌化疗中对表柔比星的增敏性及其作用机制的研究〔J〕.中国癌症杂志,2010;20(9):646-51.

3雷柱云,张有正,盛家宁,等.紫杉醇联合表柔比星治疗晚期乳腺癌的临床疗效〔J〕.海南医学院学报,2012;18(5):638-40.

4徐武夷,杨 文.乳腺癌治疗进展〔J〕.海军总医院学报,2011;24(1):29-33.

5胡 薇,施俊义,盛 湲,等.吡柔比星或表柔比星联合紫杉醇新辅助化疗治疗局部晚期乳腺癌的随机对照研究〔J〕.第二军医大学学报,2010;31(1):70-3.

6沈镇宙,柳光宇,苏逢锡,等.多西紫杉醇加表柔比星治疗局部晚期乳腺癌的多中心П期临床研究〔J〕.中华肿瘤杂志,2005;27(2):126-8.