SATB1基因对小细胞肺癌增殖、侵袭及凋亡的影响

黄 波 王晓东 郎贤平

(辽宁医学院附属第一医院胸外科，辽宁 锦州 121000)

小细胞肺癌(SCLC)是一种特殊类型的肺癌，占肺癌的15%～20%。SCLC侵袭性强，生长迅速且早期容易出现远处转移〔1〕。虽然SCLC对化疗和放疗敏感，但它容易复发和耐药。因此寻找SCLC的相关基因尤显重要。富含AT-序列结合蛋白1(SATB1)是一种核基质结合区结合蛋白，参与染色质合成和组织特异性基因表达〔2〕。 SATB1主要表达在胸腺细胞其调控T细胞的发育与成熟〔3〕。 有报道显示SATB1与乳腺癌的转移及预后不良有一定的相关性〔4〕。RNA干扰SATB1可引起侵袭性较强的癌细胞超过1 000个基因的表达改变，并能有效地抑制细胞的增殖，侵袭，肿瘤的生长和转移。SATB1-RNAi技术已证实其对于肝癌细胞、胃癌细胞等肿瘤细胞的侵袭能力均有一定的抑制作用〔5～9〕，而在SCLC细胞中SATB1基因的干扰RNA的效果尚缺乏报道。本研究将针对SATB1-siRNA对SCLC的作用进行初步探讨。

1 材料和方法

1.1材料 人SCLC细胞株NCI-H446由中国科学院细胞库引进。新生小牛血清购于杭州四季青公司，RPMI-1640培养基和lipofect2000购于美国invitrogen公司。pRNAT-U6.1/Neo购于上海闪晶生物公司，大小6.4 kb。携带有绿色荧光蛋白报告基因，其两端分别带有BamH I和EcoR I.酶切位点。菌株JM109、DH5α均购于大连宝生物公司。引物设计、合成以及测序由大连宝生物公司完成。SATB1-siRNA-1，SATB1-siRNA-2为RNA干扰序列，SATB1-siRNA-N为无意义干扰序列。

1.2siRNA载体构建 将合成的SATB1基因的siRNA引物si-1正义链：5'-GATCCCCGGATTTGGAAGAGAGTGTCTTCAAGAGAGACACTCTCTTCCAAATCCTTTTTGGAAA- 3'；反义链：5'-AGCTTTTCCAAAAAGGATTTGGAAGAGAGTGTCTCTCTT GAAGACACTCTCTTCCAAATCCGGG-3'；si-2正义链：5'-GATCCCCGTCCACCTTGTCTTCTCTCTTCAAGAGAGAGAGAAGACAAG GTGGACTTTTTGGAA A-3'反义链：5'-AGCTTTTCCAAAAAGTCCACCTTGTCTTCTCTCTCTCTTGAAGAGAGAAGACAAGGTGGAC GGG-3'；si-N正义链：5'-GATCCGCGAGACCTCAGTATGTTACCTGTGAAGTAACATACCACAGATGGGGCTGAGGTCTCGCTTTTTTG-3'。退火并将退火产物与RNAi-Ready pSIREN-DNR载体4℃过夜充分连接。热转化至DH5α中，分别命名为SATB1-siRNA-1，SATB1-siRNA-2，SATB1-siRNA-N，涂布平板后，37℃过夜培养。从转化平板上挑取阳性单菌落，进行扩增，检测阳性克隆，并测序。

1.3细胞转染 转染前1 d，NCI-H446细胞用胰酶消化，接种于6 孔板，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基，当细胞达到60%～70%融合时，准备转染。转染当天更换为无胎牛血清的RPMI-1640培养基，每个培养孔1 000 μl。取lipofect2000 10 μl，按照转染试剂∶DNA(μg)为10∶2 的比例加入构建成功的载体DNA，混匀后室温孵育30 min，加入到6孔板中培养，6 h后加入100 μl胎牛血清。转染48 h后，荧光显微镜下观察转染情况。转染成功后检测各项指标。

1.4Western印迹鉴定沉默效果 收取部分细胞，加入预冷裂解缓冲液，剪碎，超声匀浆，低温超速离心。吸取上清液，Lowry法测定蛋白浓度，SDS-PAGE凝胶90 V 电泳3 h 后转印。洗膜后1%BSA封闭非特异性抗原2 h。缓冲液洗膜，与一抗(1∶250)4℃孵育过夜。洗膜后与碱性磷酸酶标记二抗(1∶200)室温下孵育2 h。NBT/BCIP显色，以NC膜上出现清晰的棕褐色条带为阳性，终止显色，漂洗并干燥后避光保存。

1.5细胞增殖能力的检测(MTT法) 用0.25%的胰蛋白酶消化转染后24 h的4组细胞(未转染组、SATB1-siRNA-1组、SATB1-siRNA-2组及SATB1-siRNA-N组)，以含有10%胎牛血清的1640培养液配置成单细胞悬液。以每孔2×103个细胞接种于96孔板中，每孔体积0.2 ml，每组细胞接种6个孔，并以培养液为空白对照，以接种后24、48、72、96 h为4个观察时间点，共铺4块板。置37℃，5%CO2孵箱中培养。24 h后取出其中一块板，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl， 37℃，5%CO2条件下继续培养4 h。弃上清后每孔加入150 μl DMSO，并震荡10 min使MTT充分溶解。用490 nm波长的酶标仪，测定各孔的吸光度值(OD值)。

1.6转染后细胞侵袭能力的检测 将转染后24 h四组细胞进行如下操作：水化后的Transwell小室放入24孔培养板中，在小室外加含15%胎牛血清1640培养液500 μl，在小室内加入200 μl肿瘤细胞悬液，细胞数为5×103，培养液为含2%胎牛血清1640培养液，每组重复6个样本。常规培养24 h，取出Transwell小室，PBS淋洗，用棉签小心擦去微孔膜上层细胞，HE溶液染色。在显微镜下计数移至微孔膜下层的细胞数，每个样本计数10个视野。

1.7流式细胞仪分析细胞凋亡 将转染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2及SATB1-siRNA-N 48 h的NCI-H446细胞未转染的NCI-H446细胞在孵育24 h后收集，70%冰乙醇固定1 h，冷PBS洗2次，计数约1×104个细胞，重悬于200 μl binding Buffer，10 μl PI(50 mg/ml)，轻轻混匀，室温避光处放置15 min，1 h内上流式细胞仪检测。

1.8统计学方法 采用SPSS17.0软件行t检验及χ2检验。

2 结 果

2.1转染结果判定 因构建的siRNA载体含有绿色荧光蛋白，转染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2、 SATB1-siRNA-N后，荧光显微镜观察细胞核膜及胞质内可见绿色的荧光(图1,图2)，未转染组无荧光表达，表明成功将质粒转入NCI-H446细胞。转染质粒后NCI-H446细胞略肿胀，部分细胞变圆，死亡，而转染SATB1-siRNA-1、SATB1-siRNA-2后细胞的数量明显少于转染SATB1-siRNA-N和空白对照组。

图1 转染siRNA-1的NCI-H446细胞(×100)

2.2SATB1-siRNA对SATB1蛋白表达的影响 Western印迹检测SATB1蛋白表达水平，可见 86 kD处一条特异条带。凝胶成像系统灰度扫描 SATB1现色条带，转染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2组与转染SATB1-siRNA-N和空白对照组相比，SATB1蛋白表达量明显下降(图3)。

图2 转染siRNA-1的NCI-H446细胞(×100)

1为空白对照组，2为转染siRNA-1组，3为转染siRNA-N组，4为转染siRNA-2组

2.3转染前后细胞增殖能力的改变 转染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2的NCI-H446细胞的增殖(17.27±1.19和15.96±1.85)与转染SATB1-siRNA -N和空白对照组细胞相比较明显受到抑制(9.07±1.36和11.81±1.65)。但转染SATB1-siRNA-N和空白对照组细胞之间以及转染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2组细胞没有显著的区别。见表1。

表1 不同组细胞吸光度值±s，n=5)

2.4转染前后细胞凋亡改变 细胞凋亡率SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2转染的细胞均显著高于转染SATB1-siRNA -N和空白对照组细胞。

2.5转染后细胞侵袭能力的检测 转染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2组在膜上的细胞数量(47±4和39±7)明显少于转染SATB1-siRNA -N和空白对照组细胞数量(78±3和75±6,P<0.05)。但转染SATB1-siRNA -N和空白对照组细胞之间以及转染SATB1-siRNA-1和SATB1-siRNA-2组细胞没有显著的区别(P>0.05)。

3 讨 论

SCLC约占全部肺癌20%～25%，其恶性程度高、发展迅速、早期可有远处广泛的转移。SCLC对放化疗敏感，近期疗效好，但90%以上的患者治疗后出现耐药进而导致复发和转移，而目前发现的与SCLC发生、发展相关的基因较为罕见〔10〕。寻找新的SCLC转移相关基因，并确定其在SCLC中的作用，对于SCLC的诊断和治疗均具有一定的意义。

SATB1是一种组织特异性表达的核基质结合区结合蛋白(MBP)，定位于3号染色体短臂2区3带，全长763个氨基酸。早期研究显示，SATB1参与胸腺细胞发育、T细胞的成熟和染色体高级结构的形成。2008年，Han等在《Nature》上首次揭示了SATB1和肿瘤侵袭转移的关系，Han等在对细胞株和乳腺癌样本的检测中发现，SATB1表达水平与乳腺癌细胞的侵袭性密切相关〔4〕。在随后的体外实验中，Han等应用了RNA干扰的方法来下调SATB1的表达，结果使高转移性细胞株MDA-MB-231和BT549的侵袭力大大下降。相反异位SATB1表达却使非侵袭性细胞株SKBR3获得了侵袭力。这些都提示，SATB1是乳腺癌细胞获得和维持侵袭力、乳腺癌发生转移的关键因素。肝癌、直肠癌、胃癌等多种肿瘤细胞的研究同样显示SATB1的过度激活及表达可导致肿瘤细胞的无限生长，抑制凋亡〔9，11，12〕。

本研究结果提示SATB1可能会成为治疗SCLC一个理想的目标基因。转移是实体瘤发展的最终步骤，是癌症患者死亡的最常见的原因。控制肿瘤细胞的侵袭和迁移，可以提高癌症患者的存活率，而SATB1在肿瘤的浸润和迁移过程中起着重要的作用，本研究结果与该方面其他肿瘤的研究基本相一致。本研究结果还表明，转染SATB1的siRNA后，SCLC细胞的增殖能力明显下降。关于SATB1影响SCLC的增殖和侵袭的机制为何? 该方面的研究相对较少，但乳腺癌方面的研究显示，SATB1改变了涉及肿瘤发生的多个方面的1 000余个基因的表达。在与转移相关的基因方面，SATB1上调了许多促转移基因，包括在转移和血管发生中起作用的metastasin(S100A4)和VEGFB，降解细胞外基质和促进肿瘤侵袭的基质金属蛋白酶(MMP)2、3和9，刺激侵袭的转化生长因子β1(TGFB1)，以及血管发生和骨转移的结缔组织生长因子(CTGF)。相反，SATB1下调了转移抑制基因BRMS1、KAI1(CD82)、KISS1和NME1(NM23)。SATB1这种核基质结合蛋白担任了基因组组织者的角色，它显著地改变了乳腺癌细胞的基因表达谱，诱导其出现侵袭性表型，从而促进肿瘤生长和转移。将进一步研究其在SCLC细胞的具体机制。

总之，本研究显示SATB1可调节的SCLC细胞的增殖、侵袭和凋亡，这可能会为因SATB1异常而引起的SCLC以及其他癌症提供重要线索。

4 参考文献

1黄 波，王晓东，郞贤平.ABCE1基因对小细胞肺癌增殖、侵袭、迁移能力的影响〔J〕.中国老年学杂志，2013；33(1)：119-21.

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3Nie H,Yao X,Maika SD，etal.SATB1 is required for CD8 coreceptor reversal〔J〕.Mol Immunol，2008；46(1):207-11.

4Han HJ,Russo J,Kohwi Y，etal.SATB1 reprogrames gene expression to promote breast tumour growth and metastasis〔J〕.Nature，2008；452(7184):187-93.

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9Nodin B,Johannesson H,Wangefjord S，etal.Molecular correlates and prognostic significance of SATB1 expression in colorectal cancer〔J〕.Diagn Pathol，2012；7(1):115.

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11Meng WJ,Yan H,Zhou B，etal.Correlation of SATB1 overexpression with the progression of human rectal cancer〔J〕.Int J Colorectal Dis，2012；27(2):143-50.

12Zheng J.Is SATB1 a master regulator in breast cancer growth and metastasis〔J〕? Womens Health(Lond Engl)，2008；4(4):329-32.