沉默信息调节因子1在肾脏衰老中的作用

叶 婷 宁 勇

(华中科技大学同济医学院附属同济医院临床营养科，湖北 武汉 430030)

衰老是一个极为复杂的过程，受多种因素调控。目前关于衰老的理论主要有自由基学说、线粒体DNA损伤学说、端粒学说和衰老的基因学说等〔1〕。氧化损伤在肾脏衰老的发生发展中起着重要作用。沉默信息调节因子1(Sirt1)是一种依赖于烟酰胺腺嘌呤二核苷酸的去乙酰化酶，可通过调控新陈代谢(热量消耗、脂肪贮存等)、维持氧化应力下线粒体的正常功能、抑制炎症以及细胞凋亡等多个方面延缓细胞的衰老〔2〕。过去几年，Sirt1已成为衰老研究中的主要领域，但对于Sirt1在肾脏衰老氧化损伤中的作用还鲜有报道。本文旨在探讨Sirt1在肾脏衰老氧化损伤中的作用。

1 材料和方法

1.1实验动物分组及标本留取 SD雄性大鼠(华中科技大学同济医学院实验动物中心提供)，常规条件下于实验动物中心分笼饲养，保持12 h的昼夜循环，室温控制在23℃左右，湿度40%～50%，自由进食水。分别饲养至3、24个月龄(青年组、衰老组，n=10)，断头处死，放血干净，生理盐水冲洗肾脏。一侧肾脏迅速分割后，一半置于液氮保存，随后-80℃保存留待蛋白质等检测中使用，一半留作病理检查。对侧肾脏立即制备组织匀浆。

1.2方法

1.2.1肾脏组织病理学分析 肾脏组织石蜡切片(2～3 μm)常规脱蜡入水，PAS 染色，普通光镜下观察肾脏组织病理改变。

1.2.2肾脏组织H2O2含量测定 肾脏组织匀浆按照H2O2检测试剂盒(BioAssay System’s peroxide assay kit，Hayward，CA)说明书进行。

1.2.3肾脏组织MDA测定 采用TBARS检测试剂盒(Cat#10009055，Ann Arbor，MI)，操作参照说明书进行。

1.2.4Western印迹 检测硝基酪氨酸(nitrotyrosine)和Sirt1的蛋白表达水平 各组分别取20 μg蛋白，进行十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)，然后电转移至0.22 μm的PVDF膜上。5%的BSA封闭2 h，用1∶1 000稀释的nitrotyrosine(Santa Cruz，Cat #sc-101358)和Sirt1(Santa Cruz，Cat # sc-15404)一抗4℃孵育过夜，用TBST振摇洗膜10 min×3次，以1∶5 000稀释的羊抗兔生物素标记二抗，室温孵育2 h后，再次用TBST振摇洗膜10 min×3 次。ECL底物化学发光(Supersignal West Dura kit，Thermo Scientific)显色后机器扫描存盘，以Scion Image 软件进行条带分析。

2 结 果

2.1肾脏组织病理学改变 衰老组可见肾小管基底膜增厚皱缩，小管上皮细胞水肿、变性、坏死，部分小管囊状扩张、萎缩，局灶性小管消失，间质增宽，炎性细胞浸润。病变严重区域可见系膜增生，节段性肾小球硬化。见图1。

图1 肾脏组织病理改变(PAS，×400)

2.2肾脏组织H2O2含量 衰老组肾脏组织H2O2含量较对照组明显升高〔(239.9±39.38)μmol/μg vs (110±19.49) μmol/μg〕(P=0.017)。

2.3肾脏组织MDA含量 衰老组肾脏组织MDA含量较对照组明显升高〔(44.42±4.17) μmol/mg vs (26.23±1.43) μmol/mg〕(P<0.001)。

2.4肾脏组织nitrotyrosine蛋白表达 衰老组肾脏组织nitrotyrosine蛋白表达较对照组显著增加(P=0.007)。见图2。

2.5肾脏组织Sirt1蛋白表达 衰老组肾脏组织Sirt1表达较对照组明显下降(P=0.002)。见图3。

2.6Sirt1蛋白表达水平与MDA、H2O2、nitrotyrosine相关性分析 肾组织中Sirt1蛋白表达水平与MDA、H2O2含量及nitrotyrosine蛋白表达均呈线型负相关(r=-0.776、-0.808、-0.868，P均<0.05)。

图2 Western印迹检测肾脏组织nitrotyrosine蛋白表达

图3 肾脏组织SIRT1蛋白质表达

3 讨 论

肾脏是衰老过程中人体器官中变化最为明显的器官之一，正常人在超过40岁后，肾小球滤过率平均每年下降1%。肾脏衰老在形态上表现为体积和重量下降，皮质相对萎缩、肾小球硬化、系膜基质增殖、间质纤维化以及炎细胞浸润〔3〕。

衰老是一个极为复杂的过程，受多种因素调控。肾脏内的氧供十分丰富，血供量大，是机体内最易产生氧自由基的器官之一。衰老的自由基理论认为衰老是自由基对细胞成分的有害进攻造成的。氧自由基造成的损害，一方面取决于氧自由基的产生，另一方面氧自由基的清除也起重要作用。氧自由基的产生及清除失去平衡是包括癌症、2型糖尿病、肥胖相关性代谢性疾病、神经退行性疾病、心血管疾病等多种衰老相关疾病的重要发病机制。〔4〕

H2O2是一种极不稳定的氧化物，易在体内分解产生羟基自由基，造成细胞的脂质过氧化，并降解为MDA。MDA可与蛋白质、核酸及某些磷脂作用，使细胞膜的流动性和通透性发生改变，从而导致细胞结构和功能的改变，加速细胞老化过程，最终引起细胞损伤、凋亡和多种疾病的发生。nitrotyrosine为内源性过氧亚硝酸阴离子(ONOO-)生成的特异性标志物，作为一种很强的氧化剂，可有效地氧化蛋白质巯基和铁硫(Fe/S)中心酪氨酸残基，使许多蛋白或酶失活，破坏线粒体结构，使DNA链断裂，从而影响代谢、抑制呼吸酶、显著减弱抗氧化酶清除氧自由基的能力、启动脂质过氧化，参与介导多种原因造成的组织损伤。本研究发现，衰老组大鼠肾脏组织中H2O2、MDA 、nitrotyrosine的含量均较青年组显著升高，因此可以推测氧化损伤代谢产物的产生介导肾脏固有细胞损伤、凋亡、变性坏死，从而导致肾小球硬化、间质纤维化等一系列病理及功能改变。

Sirt1是Sirtuins 家族最主要的成员，其靶蛋白包括组蛋白和转录因子等。作为最被广泛和深入研究的Sirtuins家族成员，Sirt1在抗衰老、肿瘤、糖脂代谢和心血管系统中发挥重要作用〔4〕。Sirt1在肾脏组织中广泛表达，在肾髓质表达明显高于皮质，尤其高表达于内髓部〔5〕。以往研究已经发现，Sirt1可抑制机体氧化应激。在Sirt1转基因小鼠模型中，适度上调Sirt1，可通过FOXO通路，促进过氧化氢酶表达，抑制机体氧化应激水平〔6〕。Vinciguerra等〔7〕研究发现，Sirt1可通过抑制氧化应激抑制心肌衰竭进程，改善心功能。Sirt1激活剂能增强视神经中Sirt1表达，减少氧自由基产生，阻止神经元的丢失和视神经的炎症性脱髓鞘〔8〕。在COPD大鼠模型，Sirt1激活剂能增强心脏SOD活性，缓解心肌氧化损伤和心室重塑〔9〕。在H2O2处理的H9C2细胞，Sirt1激活剂能诱导线粒体NDUFA1，NDUFA2，NDUFA13和Mn-SOD表达，减少氧自由基产生，这种作用可以被Sirt1抑制剂烟酰胺所抑制〔10〕。本研究发现，衰老组肾脏组织Sirt1表达较青年组明显下降，并且Sirt1表达与氧化损伤产物负相关。因此，我们推测，随着年龄的增长，肾脏组织Sirt1表达逐渐降低，从而使机体抗氧化损伤的自我保护机制减弱，而介导肾脏衰老的发生发展。在近几年的研究中，Sirt1已成为对于衰老和长寿具有关键作用的调控因子，在肾脏衰老中是否也能通过其他途径发挥作用有待进一步研究。

4 参考文献

1李凌娟，胡庆亮. SIRT1与衰老分子机理研究进展〔J〕.绿色科技,2013;5:292-4.

2Kume S, Kitada M, Kanasaki K,etal. Anti-aging molecule, Sirt1: a novel therapeutic target for diabetic nephropathy〔J〕. Arch Pharm Res,2013;36(2):230-6.

3Kanasaki K1, Kitada M, Koya D. Pathophysiology of the aging kidney and therapeutic interventions〔J〕. Hypertens Res,2012;35(12):1121-8.

4Mimura T, Kaji Y, Noma H,etal. The role of SIRT1 in ocular aging〔J〕. Exp Eye Res,2013;116:17-26.

5曹 荣，张晓燕，康继宏，等。Sirt1 在肾脏疾病中的作用〔J〕.生理科学进展，2013;44(4):305-9.

6Salminen A，Huuskonen J，Ojala J，etal.Activation of innate immunity system during aging: NF-κB signaling is the molecular culprit of inflammaging〔J〕.Ageing Res Rev,2008;7(2):83-105.

7Vinciguerra M，Santini MP，Martinez C，etal.mIGF-1 /JNK1 /SirT1signaling confers protection against oxidative stress in the heart〔J〕.Aging Cell，2012;11(1):139-49.

8Khan RS, Dine K, Das Sarma J,etal. SIRT1 Activating compounds reduce oxidative stress mediated neuronal loss in viral induced CNS demyelinating disease〔J〕. Acta Neuropathol Commun,2014; 2(1):3.

9Hu YX, Cui H, Fan L,etal. Resveratrol attenuates left ventricular remodeling in old rats with COPD induced by cigarette smoke exposure and LPS instillation〔J〕.Can J Physiol Pharmacol,2013;91(12):1044-54.

10Li YG, Zhu W, Tao JP,etal. Resveratrol protects cardiomyocytes from oxidative stress through SIRT1 and mitochondrial biogenesis signaling pathways〔J〕. Biochem Biophys Res Commun,2013;438(2):270-6.