皮肤病理性瘢痕及瘢痕癌组织中Smad mRNA和蛋白检测及基因突变

李明华 刘进辉 白晓龙 李宏伟 吕东亮 郭京丽 刘冬梅 宋 斌

(吉林省人民医院烧伤整形外科，吉林 长春 130021)

皮肤瘢痕的产生是机体对创伤修复正常的、必然的生理反应，也是创伤愈合过程的必然结果。瘢痕不具备正常皮肤组织结构及生理功能，是一种失去正常组织活力的、异常的、不健全的组织。病理性皮肤瘢痕又称为异常疤痕，是增生性瘢痕(HS)和瘢痕疙瘩(K)的统称，是以胶原等大量结缔组织基质过度产生和沉积的皮肤纤维化疾病。有研究表明病理性瘢痕的发生率波动于8%～16%，部分病理性瘢痕具有增殖性，呈现持续生长亢奋表现，不但影响患者的美观、生理功能，且在长期受压、持重、牵拉、摩擦、抓痒等不良刺激影响下有癌变可能〔1～3〕。丝/苏氨酸激酶受体(Smad)是TGF-β信号转导途径重要标志性因子，介导了TGF-β的胞内信号转导，而TGF-β信号传导通路广泛参与细胞及组织的生理病理过程，且尤与细胞基质沉淀以及纤维化密切相关，是伤口愈合及瘢痕形成的主要生物信号途径之一。本文通过观察不同瘢痕组织的smad因子拟揭示瘢痕癌及其他纤维化疾病、癌症的发病机制。

1 资料与方法

1.1一般资料 标本来源于本院2009年1月至2013年2月病理科。20份病理性瘢痕组织标本设为观察A组，男11例，女9例，年龄29～81〔平均(42±5.32)〕岁，来源部位：头面部9例，上肢6例，下肢5例，均有疤痕形成史。20份瘢痕癌组织标本设为观察B组，男10例，女10例，年龄30～81〔平均(42±7.11)〕岁，来源部位：头面部8例，上肢7例，下肢4例，臀部1例，疤痕形成原因：火烧伤11例，电击2例，油烫伤7例。20份正常皮肤组织设为对照组，男11例，女9例，年龄31～82〔平均(43±6.91)〕岁，部位：头面部7例，上肢8例，下肢3例，臀部2例。三组标本年龄、性别、来源部位等一般情况无统计学差异(P>0.05)，具有可比性。

1.2检测方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化(SP)进行检测，抗体使用兔抗人Smad单克隆抗体(Abcam生物公司)，操作按照说明书进行。结果判定：Smad阳性表达是细胞质出现棕色颗粒；每张切片随机选择5个视野，统计着色细胞与未着色细胞的比值(阳性率)。根据阳性率×染色强度计分的乘积将免疫组化阳性等级分为4个等级：阴性：积分<2分；弱阳性：积分2～3分；阳性：积分4～6分；强阳性：积分>6分〔4〕。

1.2.2实时荧光(Real-time)PCR dNTP、Pfu酶均购于上海生工生物工程有限公司；PCR产物纯化试剂盒及质粒提取试剂盒均购自上海生工生物工程公司，基因组DNA提取试剂盒购自Promega公司。三组组织的标本各100 mg加入500 μl的Trizol试剂( Invtrogene公司)和100 μl的氯仿，均匀混合后置于离心机14 000 r/min离心10 min，将上层水相置于新的EP管后加入同等体积将RNA沉淀，干燥后加入10 μl用DEPC处理去离子水溶解的RNA沉淀，置于-80℃保存。针对国内Smad的基因片段保守区域，根据GenBank收录的Smad基因序列设计引物，Smad正义：5′-CGCTTGATCCAAAGTGGAAT-3′，反义：5′-GGTTGATGGCATTGGAAAGA-3 ′；GAPDH正义：5′-ACTTAGTT-GCGTTACACCCTTTCT-3′，反义：5′-TTCATACATCTCAAGTTGGGGGAC-3′。由厦门鹭隆生物技术有限公司合成并标记。Real-Time PCR操作方法按照试剂盒说明书，使用GAPDH作为内部参照，反应条件：预变性95℃ 15 min；变性95℃ 40 s，退火62℃，延伸72℃ 60 s，共35个循环，PCR产物为800 bp。扩增Ct值利用lightcycler荧光定量PCR仪配备软件进行分析。以对照组ΔCt值作为校正，根据2-ΔΔCT数值计算得出检测指标基因浓度。

1.3统计学处理 采用SPSS18.0软件，组间比较采用t检验；计数资料用等级相关(Spearman)分析及χ2检验。

2 结 果

2.1免疫组化结果 Smad阳性染色部位以细胞质为主，观察B组阳性表达率为57.34%，高于观察A组和对照组(分别为11.77%、11.69%)(P<0.05)，观察A组和对照组之间无统计学差异(P>0.05)。见图1。

图1 三组Smad蛋白表达情况

2.2Real-Time PCR结果 观察B组Smad基因表达水平(2.99±1.09)高于观察A组(1.39±0.78)和对照组(设为1)(P<0.05)，观察A组和对照组之间无统计学差异(P>0.05)。

2.3Smad与Smad mRNA相关性分析 瘢痕癌标本中Smad蛋白与Smad mRNA的表达有正相关关系(r=0.752，P=0.001)。

2.4Smad基因突变分析 PCR扩增后在40例无任何血缘关系的标本样品中扩增出200 bp的Smad基因6例，其中病理性瘢痕及瘢痕癌各3例(图2)；致病性与非致病性突变位点未在测序时发现。

1～3：病理性瘢痕；4～6：瘢痕癌

3 讨 论

创伤伤口愈合经过上皮化环节后，TGF-β信号转导通路在成纤维细胞内被激活，使体内合成和分泌更多的TGF-β受体，靶基因被持续性启动；又由于TGF-β信号传导通路与细胞基质沉淀以及纤维化密切相关，通路被过度激活后导致细胞外基质被过度沉淀，最终形成疤痕。Smad是TGF-β信号转导通路的标志性蛋白，Smads家族蛋白在将TGF-β信号从细胞表面受体传导至细胞核的过程中起到关键性作用，TGF-β1对细胞进行刺激后，TGF-β1型受体被磷酸化，与下游的Smad2/Smad3相互识别编码后被活化，与此同时与Smad4结合成由异源寡聚体形成的复合体，继而发生核转移，从细胞质转移到细胞核后启动靶基因，促进靶基因的启动和转录。Smad7在Smad家族中发挥抑制TGF-β1的作用，通过负反馈的效能降低TGF-β1的强度和活性时间，同时抑制TGF-β/Smad信号通路激活〔5～9〕。

Smad蛋白能够抑制和分化角质细胞，角质细胞分泌的角质细胞生长因子对组织损伤具有明显的促进修复和保护作用，Smad在一定程度上削弱了角质细胞修复组织的作用，Annes等〔9〕发现Smad3基因敲除小鼠体内角质细胞分裂更快，烧伤创面感染率下降，伤口愈合恢复更迅速，这一结果提示TGF-β信号通路通过Smad蛋白抑制角质细胞的增殖而影响伤口组织愈合。本研究结果提示瘢痕癌中Smad的高表达可能与癌变相关，Smad蛋白可能是瘢痕上皮癌变的危险信号。故笔者认为抑制Smad蛋白的活性和浓度，可加速上皮细胞的增殖分化，下调沉淀基质的数量，减少创口肉芽组织形成，减少瘢痕伤口在不良刺激作用下发生癌变的风险。

Smad基因突变或者缺失会影响细胞正常分化，出现蛋白功能异常〔10，11〕。本研究扩增突变基因检测结果显示6条目的条带均未见致病性与非致病性突变位点，笔者认为出现这一结果不排除与本次研究标本量较少有关。

总之，Smad表达升高可能与瘢痕癌相关，下调Smads基因表达和抑制Smad蛋白活性将可能成为治疗瘢痕癌的药物靶方向，从Smad角度研究病理性疤痕皮肤和疤痕癌之间发生发展时间关系是可行的。

4 参考文献

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2Shi Y，Massague J.Mechanisms of TGF-beta signaling from cell membrane to the nucleus〔J〕.Cell，2011；113(6)：685-700.

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4Cai Y，Shen XZ，Zhou CH，etal.Abnormal expression of Smurf2 during the process of rat liver fibrosis〔J〕.Chin J Dig Dis，2010；7(4)：237-45.

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8夏 炜，郭树忠.增生性瘢痕不同时期tgfβ1及其受体的表达〔J〕.第四军医大学学报，2009；20(11)：934-6.

9李 欣，戴立里.转化生长因子β1/Smads信号转导途径及其与肝纤维化的关系〔J〕.重庆医学，2007；36(18)：1887-9.

10Annes JP，Munger JS，Rifkin DB.Making sense of latent TGF beta activation〔J〕.J Cell Sci，2009；116(Pt 2)：217-24.

11陈 琛，叶冬梅，邵淑娟.转化生长因子-β/Smad信号通路研究进展〔J〕.医学分子生物学杂志，2011；3(2)：126-8，32.