CD31基因单核苷酸多态性及血清水平与肝癌的关系

方 日 谢金龙 王小文 颜娇贵

肿瘤细胞在相关因素诱导下，突破基膜大量生长繁殖并且促进新生血管分化，在癌症的发生和发展过程中发挥重要作用。血小板内皮细胞黏附分子-1(platelet endothelial cell adhesion molecule-1，PECAM-1，又称为CD1)同肿瘤细胞黏附、浸润生长和远处转移紧密相关[1]。各类炎症性疾病同CD31基因多态性具有一定的关联[2]。在此次研究中，我们通过聚合酶链反应及限制性片段长度态性(PCR-RFLP)技术，研究CD31基因单核苷酸Gly670Arg(C2008T)、Asn563Ser(T1688C)和Leu125Va(C373G)的多态性及血清水平与肝细胞肝癌的相关关系。

1 材料与方法

1.1 一般资料

选取2009年3月-2012年6月，本院普外科收治入院的原发性肝癌患者160例归为肝癌组，其中男性113例，女性47例，年龄28.3～63.5岁，平均为(45.6±7.4)岁。肝细胞肝癌的诊断均满足世界卫生组织(WHO)的诊断标准[3]，并且都经过CT和病理活检确诊。选取同期在本院接受体检的健康对照者160例归为对照组，其中男性107例，女性53例，年龄26.5～59.7岁，平均为(43.5±6.9)岁。160例健康对照组经常规体检，各项指标和临床症状均正常，无家族遗传病史。

1.2 研究方法

1.2.1 提取基因组的DNA 收集清晨2 ml的静脉血，提取白细胞的基因组DNA时，采用福州迈新生物技术公司生产的DNA提取试剂盒，并在-70℃的环境中保存留作备用。

1.2.2 PCR引物的设计和扩增 以Genbank公布的基因序列(NC_000017)为参考设计出3对引物，由上海信然生物技术有限公司合成。进行特异性扩增的CD31基因包含Leu125Val位点的一段DNA引物序列，其上游引物为：5’-GCTCCATCTGCTTGCCTGT-3’；下游引物为：5’-TGTCAGCACCACCTCTCACG-3’。进行特异性扩增CD31基因包括Ser563Asn位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5’-TGGAGACCCTGACTCACCTC-3’；下游引物为：5’-TGCAATGTGCTGTGAATGAA-3’。进行特异性扩增CD31基因包含Arg670Gly位点的一段DNA引物序列，上游引物为：5’-TGGGAAATIATCCACAGTCCTTCA-3’；下游引物为：5’-CAACTAGGTCACAATGACGATGCC-3’。CD31的PCR扩增反应体系均为25 μl，包括10×PCR缓冲液2.5 μl，2.5 mmol/L dNTPs 2.0 μl，上、下游引物各为20 pmol，模板DNA 2.0 μl，TaqDNA聚合酶1.25 U，不足部分的体积用灭菌蒸馏水补足到25 μl。置于热循环仪(Bio-Rad)中94 ℃预变性5 min；再根据下列步骤循环35次，即94 ℃变性30 s，61 ℃退火45 s，72 ℃延伸45 s；末次循环后，72 ℃延伸5 min。

1.2.3 特异性扩增的CD31基因限制性酶切 选取经过PCR扩增的产物2 μl，分别采用2 U限制性内切酶PvuⅡ、NheⅠ和MspⅠ(日本宝生物TAKARA公司)酶切CD31基因Ser563Asn、Arg670Gly和Leu125Val位点，于37 ℃保温箱孵育3 h后，待反应中止后，剩余片段在8%的聚丙稀酰胺凝胶上电泳，然后EB染色，判断电泳结果。

1.2.4 检测血清CD31含量 通过酶联免疫吸附实验测定CD31的血清含量，试剂盒为北京百泰克生物技术有限公司生产，严格按照使用说明进行操作。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 CD31的基因型分析

2.1.1 CD31基因Leu125Val的多态性 经过聚合酶链反应扩增的产物片段长度为245 bp，并依据限制性内切酶PvuⅡ酶切片段的状况，可将其基因型分为3种，Leu/Leu型(245 bp，1条带)，Leu/Val型(245 bp，193 bp，52 bp 3条带；52 bp电泳带已经跑出胶外)，Val/Val型(193 bp，52 bp 2条带；52 bp电泳带也已经跑出胶外)。

2.1.2 CD31基因Ser563Asn多态性 经过聚合酶链反应扩增的产物片段长度为236 bp，并依据限制性内切酶NheI酶切片段的状况，可将其基因型分为3种：Asn/Asn型(236 bp 1条带)，Ser/Asn型(236 bp，127 bp，109 bp 3条带)，Ser/Ser型(127 bp，109 bp 2条带)。

2.1.3 CD31基因Arg670Gly多态性 经过聚合酶链反应扩增的产物片段长度为165 bp，并依据限制性内切酶MspI酶切片段的状况，可将其基因型分为3种，Arg/Arg型(165 bp 1条带)，Gly/Arg型(165 bp，140 bp，25 bp 3条带，25 bp电泳带已经跑出胶外)，Gly/Gly型(140 bp，25 bp 2条带；25 bp电泳带已经跑出胶外)。

2.2 对照组与肝癌组CD31基因单核苷酸多态性分布频率的对照

CD31的基因型在2组人群中的分布频率，经Hardy-Weinberg遗传平衡定律检验，符合遗传平衡的标准，满足群体代表性。通过χ2检验及相关数据分析，CD31基因Leu125Val位点基因型在2组人群中的分布中具有显著的差异(χ2=10.875，P<0.05)；等位基因频率在2组人群中的分布也具有显著的差异(χ2=10.534，P<0.05)。通过分析等位基因频率的相对风险，可以发现，Val等位基因的携带者患肝癌的风险为Leu等位基因的1.457倍(OR=1.457，95%CI：1.187～2.186)；CD31基因Gly670Arg和Asn563Ser的单核苷酸多态性在2组人群中的分布没有统计学意义，见表1。

2.3 2组人群中CD31血清含量的对比

肝癌组患者血清CD31含量为(85.4±35.8)，显著高于对照组(58.7±20.5)，差异具有统计学意义(t=8.187，P<0.01)。

2.4 CD31基因的单倍型和连锁不平衡分析

通过对CD31基因3个位点(Leu125Val、Arg670Gly和Ser563Asn)的单核苷酸多态性进行连锁不平衡分析，结果表明这3个位点的单核苷酸多态性具有非常强烈的连锁不平衡。结合对基因型的研究分析进一步表明，Val-Ser-Arg基因单倍型携带者与对照组相比，患肝癌的风险较高(OR=1.487，95%CI：1.092-2.038)。见表2。

表1 对照组与肝癌组CD31基因单核苷酸多态性分布频率的对照/例

表2 CD31基因的单倍型和连锁不平衡分析(例，%)

3 讨论

原发性肝癌在发生和发展的过程中常常会由于抑癌基因或者癌基因发生突变[4-5]，从而导致相关因子无法表达或者表达紊乱。有研究表明[6-7]，遗传因素在原发性肝癌的发病中起到重要作用，部分致病基因逐步被发现，但具体的致病机理尚未完全研究透彻。

血小板内皮细胞黏附分子-1(PECAM-1，又称为CD1)属于黏附分子免疫球蛋白超家族的重要部分，同肿瘤细胞黏附、浸润生长和远处转移紧密相关[8-9]，其大部分由血小板或者血管内皮细胞表达、合成和分泌。当肿瘤细胞突破基质浸润生长时，与血小板相互接触和作用后，产生一系列活性介质，有助于肿瘤细胞黏附在血管内皮上[10]。CD31是由15个内含子和16个外显子构成，位于17号染色体长臂上(17q23)，其存在T1688C、C2008T和C373G 3种单核苷酸多态性，位于第8、12和第3位外显子上[11]，分别会导致Gly670Arg、Asn563Ser和Leu125Val氨基酸发生一系列的变化改变，进而会影响CD31基因翻译、转录、表达，继而改变其在机体内的功能和作用，最终体现在引起一系列CD31相关联疾病的发生、发展和转归过程中。

目前有研究证据[12-13]表明CD31基因的单核苷酸多态性同冠心病等心血管系统疾病有密切的联系，而其基因多态性及血清CD31含量同原发性肝癌之间的关系尚无相关报道，此次研究通过聚合酶链反应及限制性片段长度态性(PCR-RFLP)技术，采用肝癌患者-健康对照者两组对照的方式，对CD31基因Asn563Ser、Gly670Arg和Leu125Val的多态性进行研究分析。结果表明，原发性肝癌患者CD31基因Leu125Val位点基因型同健康人群相比具有显著的差异(χ2=10.875，P<0.05)，通过分析等位基因频率的相对风险，可以发现，Val等位基因的携带者患肝癌的风险为Leu等位基因的1.457倍(OR=1.457，95%CI：1.187～2.186)，表明Val等位基因有很大可能为肝癌的遗传易感基因。而通过对CD31基因3个位点(Leu125Val、Arg670Gly和Ser563Asn)的单核苷酸多态性进行连锁不平衡分析，结果表明这3个位点的单核苷酸多态性具有非常强烈的连锁不平衡。结合对基因型的研究分析则表明，Val-Ser-Arg基因单倍型携带者与对照组相比，患肝癌的风险显著增高。上述研究结果表明，CD31基因Leu125Val多态性和Val-Ser-Arg基因单倍型在肝癌的发生、发展中可能具有一定的相关性；而CD31基因Asn563Ser和Gly670Arg的多态性同肝癌的发生并无多大关联。

在此次研究过程中，检测了肝癌患者和健康对照者血清CD31的含量，结果表明肝癌组患者血清CD31含量显著高于对照组，差异显著。此外，有相关研究表明[14]，Val基因型携带者的肝癌患者体内血清CD31含量显著比不携带者要高，可以认为CD31基因Leu125Val的单核苷酸多态性会对于血清含量的表达造成一定的影响。因而，在肝癌发生的早期，携带Val基因型的患者可能会由于CD31基因在体内高度表达而增加罹患肝癌的可能性。

综上所述，原发性肝癌是由遗传、环境和生物等多种因素所造成的恶性肿瘤。通过此次研究表明，CD31基因的Leu125Val多态性及Val-Ser-Arg单倍型与原发性肝癌具有一定的关联，其中Val等位基因有极大的可能是原发性肝癌的遗传易感基因，携带Val基因型的患者可能会由于CD31基因在体内高度表达而增加罹患肝癌的可能性。CD31基因单核苷酸多态性及血清水平与肝癌的相关研究才刚刚开始，期待能有更多的深入的研究报道，以期为预测肝癌的患病风险、早期检测和发现肝癌及其治疗提供全新的方式。

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