SiRNA沉默TRPC1基因对肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的影响观察

金 丹 吴明勇 刘建刚 袁淑芬 陈晓品

肺癌是我国目前发病率较高的癌症之一，根据相关调查，男性的发病率高于女性，肺癌已经成为男性发病和死亡率最高的癌症。最近几年，肺癌的临床治疗的研究目标集中在基因水平上的靶向治疗。根据研究[1]，TRPC1是第一个哺乳动物电位受体蛋白，属于非选择性阳离子蛋白通道，对癌症细胞的增殖和侵袭等多种癌症细胞的恶性行为产生一定的影响。我院针对SiRNA沉默TRPC1基因对肺腺癌A549细胞增殖和侵袭的影响效果展开实验研究，取得的效果比较满意，现在将研究结果总结报告如下。

1 材料与方法

1.1 临床材料

主要材料：实验室保存的在37℃下、5% CO2的细胞培养箱中、RPMI-1640培养液中培养的肺腺癌A549细胞，美国Sigma公司生产的MTT，美国Abcam公司生产的抗人TRPC1的一抗，美国Gibco公司生产的RPMI-1640培养基，孔径为8.0 μm的小室，Cy3标记物，美国Invitrogen公司生产的LipofectamineTM2000。

1.2 方法

TRPC1-SiRNA转染A549细胞：将A549细胞接种于6孔板，细胞密度为每个孔2×105。第二天用血清培养液稀释TRPC1-SiRNA(已经进行Cy3标记物标记)250 μl，浓度分别稀释到20、30、50以及100 mmol/L，然后与5 μl的LipofectamineTM2000室温下孵育5 min后轻轻混合再孵育20 min,然后加入到6孔板接种的A549细胞的每个孔，在37℃下、5% CO2的细胞培养箱中6 h后换血清培养液分别培养24 h、48 h以及72 h。然后进行荧光定量PCR检测。并计算转染速率。

A549细胞的增殖检测：将等量的100 mmol/L TRPC1-SiRNA转染A549细胞、未转染A549细胞以及转染试剂接种于8块96孔的培养液中，密度是2×103，在5%CO2的细胞培养箱中培养。每孔加入20 μl的MTT培养液，4 h后吸取培养液的上清液，加入150 μl DMSO，应用酶联免疫标记分析仪测定光密度值，计算增殖时间。

A549细胞侵袭实验：先按照实验室标准制备细胞侵袭实验需要的小室膜。将未转染A549细胞、TRPC1-SiRNA转染A549细胞以及转染试剂400 μl加入上室，等量的培养液加入下室。4%多聚甲醛固定15 min，然后进行染色、水洗和风干。制片封片后在显微镜下观察并计算每个孔平均穿膜数。

1.3 观察指标

观察TRPC1-SiRNA转染A549细胞在不同浓度、不同时间下的转染速率，观察未转染A549细胞、TRPC1-SiRNA转染A549细胞以及转染试剂的增殖时间和穿膜细胞数。分析TRPC1-SiRNA对肺腺癌的治疗作用。

1.4 统计学处理

应用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析，多组间计量资料采取F检验，以P<0.05为具有统计学意义。

2 结果

2.1 不同浓度和时间下TRPC1-SiRNA转染速率情况

100 mmol/L TRPC1-SiRNA(Cy3标记物标记后)转染A549细胞48 h速率，明显大于其他浓度时的速率。TRPC1-SiRNA(Cy3标记物标记后)转染A549细胞48 h和100 mmol/L浓度下转染速率最大，两个对照组的转染时间和浓度也设定为48 h和100 mmol/L浓度，见表1。

表1 不同浓度TRPC1-SiRNA转染不同时间的转染速率结果

注：#为转染48 h，与其他浓度TRPC1-SiRNA转染速率相比，P<0.05；100 mmol/L TRPC1-SiRNA浓度下，与其他时间的转染速率相比，# 为P<0.05。

2.2 MTT法检测A549细胞的增殖时间

TRPC1-SiRNA基因转染A549细胞增殖时间明显短于未转染组和转染试剂对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表2。

表2 MTT法检测A549细胞的增殖时间结果

注：#为与未转染组和转染试剂组比较，P<0.05。

2.3 肺腺癌细胞侵袭能力实验结果

TRPC1-SiRNA基因转染A549细胞侵袭实验中穿膜细胞数明显少于未转染组和转染试剂对照组，差异均具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 肺腺癌细胞侵袭能力实验中穿膜细胞数结果

注：#为与未转染组和转染试剂组比较，P<0.05。

3 讨论

肺腺癌是肺癌的1种，主要致病因素是支气管上皮细胞癌变，少数是支气管的粘液腺发生癌变。绝大多数较小的支气管细胞癌变的肺腺癌属于周围型肺癌。肺腺癌发病早期显的临床症状表现不明显，患者不易察觉，胸部 X 线检查时肺腺癌可以被发现。肺腺癌肿瘤形状为圆形或椭圆形，据观察生长速度比较缓慢，一般血行转移发生在癌症早期，淋巴转移发生在肺腺癌晚期[2-3]。

TRPC1是位于细胞膜上的一类重要的非选择性阳离子通道家族之一。曾有研究报道过钙离子与肿瘤关系密切，能够参与到肿瘤的增殖和侵袭等恶性生物学行为中[4]。非选择性阳离子通道TRPC1作为调控细胞钙离子通道的物质，以前部分学者认为该物质参与到受体介导的、钙依赖的平滑肌以及腺体的分泌和收缩功能。最近有国外研究证明[5-7]，TRPC1与肿瘤细胞的增殖和侵袭行为等有关。SiRNA是通过RNA干扰技术在体内或者体外培养产生的，会抑制同源性基因的表达，使同源细胞沉默，所以称之为沉默基因。曹新梅等[8]研究证实SiRNA可以抑制某些癌基因的表达，从而抑制肺癌细胞的增殖、侵袭等恶性生物行为。本院的研究结果证明，SiRNA沉默TRPC1基因可抑制A549细胞的增殖能力，降低A549细胞的侵袭能力，本院这一研究结论恰好结合了国内外对于SiRNA和TRPC1的研究结论。黄栋等人曾经针对SiRNA沉默B7-H4基因转染A549细胞进行转染速率、癌细胞增殖、侵袭以及转移能力的研究，部分结论与本院的SiRNA沉默TRPC1基因相似[9-10]。结合国内外多位医学专家学者针对SiRNA各个亚型沉默基因的研究结论证实确实对癌细胞的恶性生物性行为有密切关系，可以应用到癌症的临床治疗中。

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