胃癌ERCC1基因甲基化的研究

朱瑞杰 王红兵

目前胃癌被认为是1种多基因遗传和表观遗传的综合性病变[1]。核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)是1种重要的DNA修复基因。本研究采用甲基化特异性PCR(MSP)技术检测胃癌ERCC1基因甲基化状态，以了解胃癌组织、相应癌旁组织及正常胃组织中ERCC1基因甲基化水平。

1 材料与方法

1.1 研究对象

收集2012年5月-2012年8月徐州医学院附属医院普外科手术切除的新鲜胃癌组织共30例。相应的30例癌旁组织作为对照组，另取10例胃部良性病变旁正常胃组织也作为对照组。癌旁组织距离癌组织5 cm以上。30例患者中男性18例，女性12例，年龄37～77岁，中位年龄53岁。所有病例术前均未接受过放化疗，每例均有详细的临床资料和手术记录，且均经术后病理检查证实。所有标本均于术后半小时内获得，液氮速冻后-80 ℃冰箱保存。

1.2 主要试剂和仪器

主要试剂：基因组DNA提取试剂、EZ DNA甲基化试剂盒-Gold、PCR试剂。仪器：PCR仪、紫外分光光度仪。

1.3 方法

1.3.1 组织DNA提取和甲基化修饰 每个样本取30 mg左右组织块进行匀浆处理，参照组织基因组DNA提取试剂盒说明书提取基因组DNA，UV3000紫外分光光度仪测定DNA浓度和纯度，OD260/OD280比值在1.8～2.0之间的DNA用于甲基化修饰。各样本DNA取800 ng，参照EZ DNA甲基化试剂盒说明书进行甲基化修饰，修饰好的DNA洗脱后于-20 ℃保存。

1.3.2 甲基化特异性 PCR (methylation specific PCR,MSP)取修饰好的DNA 2 μl进行MSP反应。ERCC1基因甲基化引物：M，F：5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGCGCGA-3′，R：5′-CAAAAAAAATAAAAACGATACAACG-3′。非甲基化引物：U，F：5′-TTTAGGATTATAGAGAGTAGTGTGA-3′，R：5′-AAAAAAATAAAAACAATACAACACC-3′。反应体系按照PCR试剂盒推荐量25 μl体系进行：PCR混合液12.5 μl，上下游引物各0.5 μl，模板2 μl，无核酶水9.5 μl。MSP循环条件：97 ℃预变性5 min，然后进行40个循环扩增：95 ℃变性40 s，甲基化引物及非甲基化引物分别在57 ℃、55 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，最后于72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。甲基化特异性引物(M)扩增的目的片段为166 bp，非甲基化特异性引物(U)扩增的目的片段为164 bp。取10 μl PCR产物在2.5%琼脂糖凝胶上电泳，以TIANGEN 100 bp DNA Ladder (MD101-01)为标准DNA Marker同步电泳，溴化乙啶染色后凝胶成像系统观察结果并记录。判断标准[2]：M阳性、U阴性为完全甲基化；M阳性、U阳性为部分甲基化；M阴性、U阳性为非甲基化。

1.4 统计学处理

统计分析应用SPSS16.0版统计软件。甲基化结果采用χ2检验。检验水准α=0.05。

2 结果

30例胃癌组织中ERCC1基因发生完全甲基化14例，发生部分甲基化9例，甲基化率为76.7% (23/30)；相应的癌旁组织中发生完全甲基化1例，发生部分甲基化3例，甲基化率为13.3% (4/30)，两者差异有统计学意义(χ2=12.15，P<0.05)。10例正常胃组织均未出现甲基化条带，见图1。

A为胃癌组织的完全甲基化；B为胃癌组织的部分甲基化；C为癌旁组织的完全甲基化；D为癌旁组织的部分甲基化；E为正常胃组织的非甲基化；M为甲基化(166 bp)；U为非甲基化(164 bp)

图1 ERCC1基因甲基化检测(MSP)

3 讨论

表观遗传学(Epigenetics)是由C.H.Waddington首先提出的。Holiday针对“Epigenetics”作出了更加系统性的论断，即“DNA序列不发生改变的情况下，所发生的可遗传性基因表达的改变”[3]，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、基因组印记、隔离蛋白以及非编码RNA调控等。DNA甲基化是基因表达的重要表观遗传学形式，在细胞生长、胚胎发育、基因表达调控、寄生DNA序列的抑制、基因组结构的稳定等方面发挥着不可缺少的作用，是目前研究最多也最为深入的表观遗传学表达机制。

核苷酸切除修复交叉互补基因1(excision repair cross-complementing gene 1,ERCC1)是DNA损伤修复基因，是核苷酸切除修复(nucleotide excision repair,NER)途径的限速步骤[4]。ERCC1基因定位于人染色体19q13.2，基因全长15 kb，含10个外显子，编码由297个氨基酸组成的蛋白质，其分子量为32.5 KD。

目前国内外关于胃癌组织中ERCC1蛋白表达的研究有报道，其结果显示[5]胃癌组织中存在不同程度的ERCC1蛋白表达低下或缺失。但针对胃癌组织中ERCC1基因甲基化的情况缺乏系统性研究。本研究采用甲基化特异性PCR技术检测30例胃癌组织、相应癌旁组织及10例正常胃组织中ERCC1基因甲基化状况，结果显示胃癌组织的甲基化率为76.7%，显著高于癌旁组织中该基因的甲基化率13.3%，差异有统计学意义(P<0.05)。10例正常胃组织均未检测到甲基化的发生。

综上所述，胃癌组织中存在高比例的ERCC1基因甲基化，为下一步研究ERCC1基因甲基化是否具有一定的临床意义打下了理论基础。

[1] Ali Z,Deng Y,Ma C.Progress of research in gastric cancer 〔J〕.J Nanosci Nanotechnol,2012,12(11):8241-8248.

[2] 尹红英,王红兵.耐紫杉醇人肺腺癌A549细胞株中BRCA1基因启动子CpG岛甲基化的研究 〔J〕.实用癌症杂志,2012,27(4):337-338.

[3] Jones PA,Baylin SB.The epigenomics of cancer 〔J〕.Cell,2007,128(4):683-692.

[4] Croteau DL,Peng Y,Van Houten B.DNA repair gets physical:mapping an XPA-binding site on ERCC1 〔J〕.DNA Repair (Amst),2008,7(5):819-826.

[5] Liu WB,Ao L,Cui ZH,et al.Molecular analysis of DNA repair gene methylation and protein expression during chemical-induced rat lung carcinogenesis 〔J〕.Biochem Biophys Res Commun,2011,408(4):595-601.